检索历史 清除

摘要目的：应用环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)检测肠道病毒71型(Enterovirus71，EV71)的核酸，为临床快速诊断EV71感染提供依据。EV71拥有复杂的免疫逃逸机制阻碍宿主细胞固有免疫应答，固有免疫是机体抵抗病原微生物感染的第一道防线，病原微生物入侵宿主细胞时，宿主通过自身模式识别受体(Pattem recognition receptors，PRRs)识别病原体的病原相关模式分子(Pathogen-associated molecular pattems，PAMPs)，刺激下游适配体蛋白级联反应，从而激活宿主细胞相应的信号通路，诱导I型干扰素(Type I Interferon，IFN-I)及多种促炎细胞因子的产生，以抵抗病原微生物的感染。研究表明，去泛素化酶在抗病毒固有免疫中发挥了重要作用，本文旨在探讨去泛素化酶USP24在EV71感染引起的固有免疫反应中的调控机制，以便为临床治疗手足口病提供新的思路。<br>　　方法：收集14例咽拭子标本，采用LAMP法检测EV71及其它常见的19种呼吸道病毒。EV71感染人横纹肌肉瘤(RD)细胞8h后，提取细胞RNA，采用PCR基因芯片法分析88种去泛素化酶的表达。USP24敲减(shUSP24)质粒转染RD细胞48h后，收集细胞提取总RNA，RT-qPCR检测EV71病毒复制水平和USP24mRNA的表达情况，进一步检测细胞IFN-D的分泌;Western blot检测转录因子IRF3的磷酸化水平。免疫共沉淀法检测USP24和TANKl结合激酶1(TANK binding kinasel，TBKl)的结合;TBKl过表达质粒与Ub，Ub-K48或Ub-K63突变质粒分别共转染HEK293T细胞，分析USP24对TBKl泛素化和蛋白稳定性的影响。<br>　　结果：LAMP法检测的14例咽拭子标本中，EV71合并人鼻病毒2例、人鼻病毒4例、人鼻病毒合并柯萨奇病毒A6型6例、人副流感病毒1型1例、人副流感病毒3型1例，其中EV71及柯萨奇病毒A6型经常州CDC q-PCR验证。EV71感染促进去泛素化酶USP24表达。免疫共沉淀试验显示内源性的USP24可以与TBKl结合;USP24特异性移除TBKl分子中的K63泛素链以降低其稳定性，从而抑制下游I型干扰素的表达及抗病毒免疫反应。EV71感染RD细胞后，细胞内的P-IRF3水平未见明显升高，而敲低USP24基因后，P-IRF3水平明显上调，IFN-13mRNA及蛋白水平也明显提高。免疫荧光抗体检测发现敲低USP24后IRF3核转位增多，并抑制了EV71的复制和减少了细胞病变效应。<br>　　结论：LAMP法可快速检测临床样本中EV71，为临床诊断EV71感染提供依据。EV71感染可上调去泛素化酶USP24，USP24能特异性移除TBKl分子上K63的泛素链，使TBK1蛋白稳定性降低，负向调控TBKl介导的IFN-I固有免疫信号通路。