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摘要病毒与宿主相互作用的过程中，进化出复杂的相互调节机制。病毒可利用自身有限的遗传信息编码更多具有生物学功能的基因、circRNA、IncRNA、miRNA和小肽。本实验室前期研究证实家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmicpolyhedosis virus，BmCPV)基因组S5节段dsRNA的负链可编码由27aa组成的小肽vSP27，且发现该小肽具抑制病毒的增殖复制的功能，但其来源及抑制病毒增殖的机制不明。因此，本研究主要聚焦于vSP27的产生方式及其延缓病毒增殖的机制研究，发现vSP27由BmCPV起源的circRNA翻译形成，vSP27通过激活ROS/NF-κB信号通路延缓病毒增殖。相关研究结果加深了BmCPV基因组所携带的遗传信息的认识，为理解BmCPV增殖复制的调控提供了新的视角。<br>　　1、BmCPV编码的vSP27的来源及确证<br>　　业已明确，一些DNA病毒可通过反向剪接(back-splicing)方式形成病毒circRNAs，且部分circRNA可以5’端帽子结构非依赖的方式翻译蛋白或小肽。本研究发现BmCPV基因组S5dsRNA负链的161-1243nt区域序列可以产生circRNA（命名为circRNA-vSP27），且circRNA-vSP27包含编码vSP27的完整小开放阅读框（small open reading frame，sORF）。本研究通过RT-PCR、Sanger测序及原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)实验证实BmCPV感染的家蚕中肠组织和BmN细胞中确实存在circRNA-vSP27。为进一步解析circRNA-vSP27的生物学功能，我们将circRNA-vSP27线性序列克隆进circRNA表达载体pIZT-LcR构建重组表达载体pIZT-LcR-circRNA-vSP27。RT-PCR和Sanger测序证实pIZT-LcR-circRNA-vSP27能在细胞中形成circRNA-vSP27。通过Western blotting可在转染了pIZT-LcR-circRNA-vSP27的BmN细胞中检测到vSP27。此外，我们用DsRed基因替换pIZT-LcR-circRNA-vSP27中的编码vSP27的sORF以构建pIZT-LcR-circRNA-DsRed。Western blotting检测表明DsRed在转染pIZT-LcR-circRNA-DsRed的细胞中成功表达。在转染细胞中，由于pIZT-LcR-circRNA-vSP27中的靶序列的转录本并不是全部形成circRNA-vSP27，即有部分仍以线性分子的形式存在;因此，为探明vSP27由线性转录本和/或circRNA-vSP27翻译，我们通过RNAi分别特异性地敲降转染细胞中circRNA-vSP27和其线性RNA分子的水平，并调查其对vSP27蛋白水平的影响，结果显示敲降circRNA-vSP27可下调vSP27水平，但敲降线性RNA分子的水平对vSP27水平无明显影响，证实vSP27主要由circRNA-vSP27编码，而非线性RNA分子。Western blotting和real-time PCR检测发现BmN细胞感染BmCPV12h后，就能检测到vSP27的表达，且circRNA-vSP27相对表达丰度低于S5节段负链RNA的水平。为探究circRNA-vSP27对病毒增殖的影响，我们以BmCPV感染pIZT-LcR-circRNA-vSP27质粒转染的BmN细胞，Western blotting和real-time PCR检测表明circRNA-vSP27过表达可抑制病毒结构蛋白VP7的蛋白表达水平及病毒基因vpl和vp2的相对表达水平，说明circRNA-vSP27具有延缓病毒增殖复制的功能。但当转染vSP27起始密码子突变成TCG的表达载体pIZT-LcR-circRNA-vSP27mut时，其延缓BmCPV增殖复制的功能减弱，因此可以认为vSP27是circRNA-vSP27抑制病毒基因表达的主因。上述结果表明BmCPV编码的vSP27由circRNA-vSP27翻译而来，且circRNA-vSP27抑制病毒基因表达的作用归因于其翻译的小肽vSP27。<br>　　2、vSP27通过激活ROS/NF-κB信号通路延缓病毒增殖<br>　　为探究vSP27抑制病毒增殖复制的机理，我们通过ROS检测、荧光观察以及Western blotting实验证明了化学合成的vSP27孵育BmN细胞会导致胞内ROS水平升高;随后利用ROS抑制剂（N-乙酰基-L-半胱氨酸，NAC）处理vSP27孵育的BmN细胞，Western blotting实验揭示了vSP27可促进NF-κB(p65)由细胞质向细胞核的转移，进而激活NF-κB信号通路。尔后，我们利用NF-κB抑制剂Bay11-7821处理BmN细胞，real-time PCR及Western blotting结果显示Bay11-7821可以阻断vSP27激活NF-κB信号通路并促进病毒VP7的表达，表明vSP27通过ROS/NF-κB信号通路抑制病毒蛋白表达。另外，还证实vSP27通过NF-κB信号通路促进抗菌肽基因（BmCecropinA、BmCecropinB和Bmlysozyme）的表达，过表达BmCecropinA和BmCecropinB基因可抑制病毒基因的表达。上述结果表明vSP27通过提高细胞内ROS水平，促进NF-κB(p65)入核，激活NF-κB信号通路使抗菌肽基因大量表达，进而抑制病毒增殖。<br>　　3、vSP27通过与Akirin互作激活NF-κB信号通路延缓病毒增殖<br>　　在进一步的研究中，我们通过免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation，Co-IP)并结合质谱分析证实vSP27能与核蛋白Akirin互作。过表达和siRNA干扰实验发现Akirin能延缓病毒的增殖复制，促进NF-κB(p65)入核，表明Akirin能激活NF-κB信号通路。此外，real-time PCR及Western blotting结果显示，用vSP27处理预先敲降akirin基因表达的细胞可促进BmCPV病毒基因的表达，而vSP27处理过表达akirin基因的细胞则表现出相反的作用，表明vSP27与Akirin互作抑制病毒增殖。上述结果表明vSP27与Akirin互作激活NF-κB信号通路，进而发挥抑制病毒增殖复制的作用。<br>　　综上所述，vSP27由BmCPV S5节段负链RNA起源的circRNA-vSP27翻译形成，vSP27通过促进ROS的产生、与Akirin互作，激活NF-κB信号通路延缓病毒的增殖复制。