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摘要当今世界高度全球化，新发突发病毒性传染病严重危害着全球人民的生命健康安全。生物界中有着大量的未知的病毒种类，他们随着时间的发展和进化，可能成为一种传染源导致严重的新发传染病。由于缺乏对未知病毒的遗传信息的认知，导致现有的临床检测手段无法检测应对。近些年来，病毒的分子生物研究和检测手段不断深入，下一代测序技术飞速发展，高通量检测手段常用于对新型未知病毒的发现和检测中，而病毒的宏基因组检测成为一种发现和获取未知病毒相关遗传信息的重要手段。<br>　　云南是我国重要边境，与缅甸，老挝，越南三国接壤。由于地理，历史和人文原因，云南与周边国家交往密切，人口流动性强。且由于经济发展原因，导致人口单方向流入我国。因此，传染病的输入风险急增。近些年间，由于缅甸、老挝、越南等登革热流行严重的国家输入病例，云南省内不断出现登革热病例;且云南的气候及地理位置也适合寨卡病毒的流行与传播，而周边国家也有报道过寨卡病毒的感染病例。因此对云南边境口岸地区发热病人的血清病毒组进行研究分析，对在源头上预防病毒性疾病的传染传播，实现关口前移具有重要意义。<br>　　方法:(1)选取五组进行预实验，探索血清样本制备的最佳方案;(2)通过运用高通量测序技术并加入生物信息学分析的病毒组学分析方法，调查我国云南边境地区登革病毒初筛阴性的发热病人携带病毒的情况;(3)利用半巢式PCR、genomewalking及末端RACE等技术获得重点病毒全基因组序列;(4)运用进化分析，研究所获病毒遗传进化特征;(5)运用重组分析，研究新鉴定出的病毒与已知病毒可能存在的重组关系，用以分析病毒的重组及致病风险。<br>　　结果:(1)通过五组预实验后，根据测序结果显示血清样本进行离心过滤后再进行酶消化提取病毒RNA，然后进行随机PCR扩增，进行电泳后对500bp以上的长度进行切胶回收所制备的血清样本再建立cDNA文库进行宏基因组测序后，所获的病毒序列最多。(2)将270份血清标本，分93组进行病毒富集，进行高通量测序后获得总数据(Rawdata)160G，质控数据(HQdata)113G，去除人源序列和细菌序列后，剩余病毒序列占8％;每个样本平均得到病毒序列:43682(中位6198)条。(3)93组样本中，病毒主要集中在单正链RNA病毒，其中主要是黄病毒和肠道病毒。检测出的病毒中主要使人致病的病毒有登革病毒(denguevirus，DENV)，主要是DENV4;疱疹病毒科(Herpesvirales)病毒;逆转录病毒科(Retroviridae)病毒;乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus，HBV);肠道病毒(Enterovirus，EV)这一批样本中也含有动物病毒，如鼠白血病病毒(Murineleukemiavirus);细小病毒(parvovirus);虹彩病毒科(Iridovirida)病毒。同时这一批样本还含有使植物致病的病毒序列，如烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus)和甜瓜坏死斑点病毒(Melonnecroticspotvirus)。(4)因为93组样本中47组含有肠道病毒，25组样本含有EVA71，17组样本含有CVA16病毒，这是手足口病的主要病原体，且肠道病毒主要是对儿童致病，如果成人携带，会导致儿童感染的可能性增加，因此对101个单独样本和混样使用肠道病毒VP1通用引物进行半巢式PCR扩增，得到11组阳性样本，将混样组的单独样本进行扩增后，将3486号样本和3390号样本血清加入细胞进行培养，3390号样本病毒分离培养失败，3486号样本病毒培养成功，培养后提取病毒核酸获得一条完整的肠道病毒序列。(5)3390号样本根据高通量测序结果结合Sanger测序，获得完整的VP1基因核苷酸序列。所获得VP1段与CoxsackievirusA6464-QJ-YN-CHN-2019-CV-A6的核苷酸同源性高达99.78％。且该参考株是2019年在云南采样获得，因此提示该血清型肠道病毒在云南地区持续流行。3486号样本分离培养出的肠道病毒的VP1段与EchovirusE4的氨基酸同源性为97.50％，核苷酸同源性在80.63％-89.9％之间。其P1段与EchovirusE4的氨基酸同源性为97.64％，符合现有的肠道病毒分型标准，因此可以判断该条序列为肠道病毒中EVB组的Humanechovirus4，由于其全基因组序列与已经获得的Echovirus4的同源性并不高，因此所获病毒可能为Humanechovirus4的一个新的分离株。对所获肠道病毒序列进行重组分析后，2A，2B，2C，3A，3B，3C，3D段均发现了重组迹象:2A段与EchovirusE304-MRS2013株发现重组迹象，在2B段与Humanenterovirus85strainHTYT-ARL-AFP02FXJCHN2011株发现重组迹象，在2C段与EnterovirusB80KOUAN67/XZ/CHN/2010株发现重组迹象;在3A段与EchovirusE14E14P9682013China株发现重组迹象;在3C，3D段与Humanechovirus301167438phMC株发现重组迹象，这些提示可能发生了重组事件。<br>　　结论:本研究对云南发热病人的血清病毒组进行了深入研究，了解了云南口岸地区潜在的病毒性病原谱及流行。云南边境地区人口流动性强，携带病毒种类复杂，不仅携带对人有致病能力的病毒，也携带了对动物和植物有致病能力的病毒。对人有致病能力的病毒包括HBV，疱疹病毒，肠道病毒等;根据分析，肠道病毒可能是我国云南口岸地区比较常见的流行病原体。通过高通量测序技术结合Sanger测序技术获得了一株CVA6的完整VP1段基因序列;并且通过细胞培养分离出一株Echovirus4。肠道病毒对成人的致病能力较弱，对儿童的致病力较强，但成人携带肠道病毒，经过肠道途径、接触和飞沫传播给儿童后，导致肠道病毒在儿童中流行，引起严重的后果;且肠道病毒重组复杂，病毒分型较多，病毒培养复杂，因此本研究对在儿童中较易流行的肠道病毒的传播途径有了新的发现，需要重点关注并提前预防。