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摘要目的:自然杀伤(naturalkiller，NK)细胞是一类重要的效应淋巴细胞，具有清除病原微生物、异常或损伤的细胞（机械损伤、程序性凋亡以）和肿瘤杀伤的独特属性;作为固有免疫应答的关键免疫细胞，不需要特异性激活和致敏即可发挥免疫作用。目前NK细胞在肿瘤免疫监测中起到了重要作用，同时包括自体输注在内的NK细胞疗法在临床应用中也展现出良好的应用前景。但是由于在人外周血中NK细胞的含量低(5％-20％)，大规模临床级高活性、高质量NK细胞的获得成为其在实际研究应用中最大的障碍。本研究的目的在于采用最传统的细胞因子联合培养来大规模制备可应用于临床治疗的NK细胞，同时保证获得的NK细胞具有高细胞毒活性并且不引发潜在的安全性问题。<br>　　内容:(1)建立基于细胞因子组合的高效制备人外周血NK细胞的体外培养体系。(2)评估细胞因子对人外周血NK细胞的扩增倍数的影响。(3)研究细胞因子诱导所得的人外周血NK细胞表面分子标志以及对整个培养体系中T细胞亚群分布的影响。(4)探讨细胞因子激活的人外周血NK细胞在细胞周期、细胞凋亡中的变化。(5)评价细胞因子联合培养获得人外周血NK细胞对肿瘤细胞系的杀伤活性。<br>　　方法:(1)以细胞因子人重组IL-2（rhIL-2，此后简写为IL-2;IL-12，IL-15，IL-18和IL-21与之相同）为对照组，将不同的细胞因子进行联合来诱导人外周NK细胞的产生，并把诱导所得的NK细胞分别命名为IL-2-NK（单独IL-2诱导）、3IL-18-NK（IL-2，IL-15和IL-18联合诱导）和3IL-21-NK（IL-2，IL-18和IL-21联合诱导）细胞，最后通过流式细胞学和免疫荧光染色等方法检测鉴定NK细胞。(2)通过形态学观察和电子显微呈像，揭示细胞因子联合培养后的人外周血NK细胞的生物学特征。(3)使用细胞群体倍增实验，碘化丙啶(Propidiumiodide，PI)DNA染色法以及AnnexinⅤ/7-AAD双染色法等实验技术，分析评价细胞因子对人外周血来源NK细胞活性的影响。(4)通过NK细胞与肿瘤细胞系K562细胞共培养后，其NK细胞表面CD107a的表达情况以及最终体系中K562细胞剩余的活细胞数，来评估经细胞因子联合诱导后人外周血NK细胞的细胞毒活性。<br>　　结果:(1)在培养体系中添加IL-2作为对照组，实验结果表明IL-2、IL-12、IL-15、IL-18以及IL-21的联合使用能够不同程度的促进人外周血NK细胞增殖，最终发现在IL-2、IL-15和IL-18(3IL-18)联合培养以及IL-2、IL-18和IL-21(3IL-21)联合培养能够明显促进人外周血NK细胞的大量扩增。(2)进一步比较3IL-18组和3IL-21组的NK细胞发现，3IL-18组的NK细胞在CD56、CD16、NKG2D表达上具有明显的优势，同时在整个培养体系中3IL-18组中T细胞的分布比例明显低于3IL-21组，且在T细胞亚群的分布中主要为CD8+T细胞和少量CD4+T细胞。(3)通过细胞凋亡分析发现，3IL-18组中的NK细胞凋亡比例较少;而细胞周期实验则证明3IL-18组的NK细胞处于S期和G2/M期的比例明显高于3IL-21组的NK细胞。(4)将细胞因子联合诱导培养14天后获得的NK细胞与肿瘤细胞系K562细胞以效应细胞∶靶细胞为1∶1和1∶3的比例共培养4h后发现，随着效靶比的降低，NK细胞表面的CD107a表达上调;另外在同一个效靶比下，3IL-18组NK细胞具有更明显的上调现象;通过统计共培养中K562细胞的剩余活细胞数计算细胞因子诱导后的NK细胞毒活性发现，3IL-18组的NK细胞具有更强的细胞毒性。<br>　　结论:在这项研究中，通过对16种不同细胞因子的联合培养进行小规模的筛选后，我们发现联用IL-2，IL-15和IL-18或者联用IL-2，IL-18和IL-21能够从外周血单个核细胞中高效地扩增NK细胞。但是通过进行多方面的分析，包括NK细胞群体扩增倍数、细胞表型、上调CD107a的表达以及对K562细胞的杀伤能力来评估NK细胞的细胞毒性活性，我们发现当在培养基中添加IL-2、IL-15和IL-18能够更有效地促进NK细胞增殖，同时获得大量的高活性NK细胞。