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摘要古菌、细菌和真核生物中编码tRNA的基因普遍含有内含子。tRNA内含子位于tRNA的反义密码环上，由tRNA剪接过程去除。经典的tRNA剪接过程包括内含子的剪切和外显子的连接。在酵母细胞中，剪接后的tRNA分子在剪接位点处含有一个多余的2''-PO4基团，需要2''磷酸转移酶(Tpt1)以NAD+依赖的方式去除。Tpt1通过两步化学反应实现2''磷酸转移酶活性:(1)2''-PO4基团攻击NAD+，产生ADP-核糖基化的tRNA中间产物，释放烟酰胺分子;(2)NAD+烟酰胺核糖的C2"-亲核基团攻击tRNA的2''-PO4，激发转酯反应，产生成熟的tRNA和ADP-1"，2"-环化磷酸。近年来，不断有研究表明，古菌和细菌中的Tpt1同源蛋白具有除2''磷酸转移酶以外的其他活性，如催化去除RNA的末端单磷酸基团。酿酒酵母Tpt1(ScTpt1)作为酵母中唯一的tRNA2''磷酸转移酶，是维持酵母生存的必需蛋白。ScTpt1仅对tRNA内部的2''-PO4具有活性，在tRNA剪接过程中的作用似乎是它的唯一使命。到目前为止，ScTpt1催化去除tRNA内部2''-磷酸化的结构机制仍不清楚。<br>　　本文以ScTpt1为研究对象，解析了ScTpt1C端结构域和NAD+复合物的晶体结构。基于对ScTpt1-NAD+复合物的结构分析，本文得出了以下结论:(1)ScTpt1通过C端结构域结合NAD+，其中Ser123、Ala132、Ser134负责结合腺嘌呤基团;His117、Gly118、Thr119负责结合腺苷核糖上的羟基;Arg138、Arg158等残基负责结合焦磷酸;烟酰胺基团则通过疏水相互作用结合在疏水腔内。(2)ScTpt1中Arg138-Arg158形成保守的“安全带”结构:NAD+进入ScTpt1前，Arg158指向结构外侧，NAD+进入ScTpt1，Arg158的侧链基团发生构象变化，向NAD+结合口袋靠拢，与Arg138形成“安全带”结构，固定NAD+的焦磷酸基团。(3)ScTpt1的活性中心位于Arg23-His24-Arg71-Arg138-Arg158形成的空间内，2''-PO4的转移发生在Arg138-Arg158附近。(4)Arg138-Arg158“安全带”横亘在烟酰胺疏水腔外，形成半开放式的腔体，tRNA的2''-PO4基团伸入半开放式的疏水腔，靠近并攻击NAD+的烟酰胺基团，改变NAD+烟酰胺核糖的构象，生成RNA2''-磷酸-ADP-核糖基化中间产物。(5)与细菌及古菌中同源蛋白相比，ScTpt1的L3是酵母特有的参与构成活性中心的loop结构，它赋予ScTpt1的活性中心更大柔性，以便结合tRNA时产生必要的构象变化。<br>　　本文还通过凝胶迁移实验(EMSA)、ScTpt1-RNA复合物组装及分子内化学交联等方法，初步探索了ScTpt1与tRNA的相互作用机制。本文发现，ScTpt1特异性识别tRNA的反义密码环结构，且不依赖剪接位点处的2''-PO4。RNA结合会诱导ScTpt1产生构象变化，化学交联使ScTpt1丧失RNA结合能力。ScTpt1的N端为RNA结合结构域，且对RNA2''-PO4具有偏好性，暗示RNA结合结构域内存在特异性识别2''-PO4的氨基酸残基。<br>　　ScTpt1-NAD+晶体结构的解析及其与tRNA互作的功能研究，揭示了ScTpt1的催化机制，初步探索了ScTpt1的RNA底物识别机制。这些发现为Tpt1抑制剂的研发提供了结构信息，在漫长且困难的抗真菌药物筛选过程中贡献一份力量。