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摘要第一部分人血浆微粒的检测及其富含线粒体内容物的验证<br>　　背景与目的:微粒(microvesicles，MVs)是表面带有磷脂酰丝氨酸且直径在0.1～1um之间由细胞释放的囊泡，其可携带来自胞质、胞核的多种成分并同脓毒症的病理生理机制相关。而与线粒体损伤相关的分子模式(mitochondrialdamage-associatedmolecularpatterns，mtDAMPs)目前也被认为同脓毒症的病理生理机制相关，且已被证明可由体外激活血小板释放的MVs所携带。然而，人血浆当中的MVs是否能携带类似上述成分尚不清楚。因此，本研究第一部分拟构建血浆MVs的检测方案并对血浆MVs是否富含线粒体内容物进行验证，为下一步研究MVs及其内容物在脓毒症中的作用奠定基础。<br>　　方法:收集脓毒症患者、健康志愿者及感染患者血浆样本，高速离心分离并提取MVs，采用已知纳米级微粒标准品对流式细胞仪进行设门并采用对数显示。应用设定后流式细胞仪对人血浆MVs进行检测，而后将其同人血浆MVs的已知特性进行比对。通过对MVs的线粒体成分进行mitotracker及anti-tom22染色并联合激光共聚焦和流式细胞术，对血浆MVs是否富含线粒体内容物进行验证。<br>　　结果:应用对数显示的AriaⅡ流式细胞仪可清晰检测到直径为1um、0.5um、0.2um的微粒标准品且分群明显。借助微粒标准品及对数显示后的流式细胞分析表明，人血浆MVs大部分位于0.1～1um之间，且MVs数目峰群位于0.2～0.5um之间。激光共聚焦分析显示血浆中存在磷脂酰丝氨酸及mitotracker双阳性的MVs。流式分析显示血浆中不仅存在磷脂酰丝氨酸及mitotracker双阳性的MVs，也存在磷脂酰丝氨酸及tom22双阳性的MVs。<br>　　结论:人血浆MVs富含线粒体内容物。<br>　　第二部分脓毒症患者血浆微粒的表达及其与炎症、内皮损伤标志物的相关性研究<br>　　背景与目的:目前MVs及mtDAMPs被认为同脓毒症介导的炎症反应有关。同时，存在差异表达的富含线粒体内容物的MVs(microvesiclescarriedwithmitochondrialcomponents，mitoMVs)已在肝炎小鼠血浆中被发现。然而，同样以炎症为病理基础的脓毒症血浆中尚未有类似发现。因此，本部分将对脓毒症组及相关对照组血浆MVs及部分炎症、内皮损伤标志物进行检测，以明确脓毒症中是否存在差异表达的mitoMVs并探讨其与上述标志物的关系。<br>　　方法:收集脓毒症组患者、感染组患者及对照组健康人血浆、血清样本，对MVs的线粒体成分进行线粒体跨膜蛋白22(tom22)染色，分别采用流式细胞术检测MVs、线粒体跨膜蛋白22阳性微粒(tom22+MVs)在上述血浆样本的表达水平，采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,Elisa)检测白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、C反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及内皮损伤标志物可溶性血管细胞黏附分子-1(sVCAM-1)在上述血清样本中的表达水平，并分析他们的相关性。<br>　　结果:本研究共纳入健康对照组20人，感染组患者34人，脓毒症组患者19人，三组之间在年龄、性别及既往病史方面无差异性。相较于对照组，感染组及脓毒症组具有更高水平的MVs(P＜0.01)。相较于健康对照组，tom22+MVs在局部感染和脓毒症患者体内表达明显升高。即便相较于局部感染患者，脓毒症患者也具有更高水平的tom22+MVs。脓毒症患者血浆当中CRP、IL-6、IL-8及TNF-α的表达水平显著高于健康对照组，且sVCAM-1的表达也有明显升高。在脓毒症组，tom22+MVs不仅与TNF-α的表达水平相关，也与sVCAM-1的表达水平相关。<br>　　结论:脓毒症患者血液当中存在显著升高的MVs、mitoMVs、炎症标志物及内皮损伤标志物。脓毒症患者mitoMVs同时与炎症反应及内皮损伤相关，其可能是内皮细胞功能障碍的原因。<br>　　第三部分脓毒症患者血浆微粒介导血管内皮损伤的研究<br>　　背景与目的:脓毒症是由感染诱导的全身炎症反应综合征，内皮细胞是参与上述炎症反应的重要成分。MVs是细胞之间进行信号传导的介质，其携带的内容物被认为同其生物活性相关。其次，mtDAMPs的多种成分均可诱导Ⅰ型IFN(Interferon，IFN)信号通路的激活。因此，在前两部分基础上，本部分拟明确脓毒症血浆MVs是否也可以诱导血管内皮细胞发生炎症反应，特别Ⅰ型IFN信号通路的激活，以及脓毒症血浆MVs富含的线粒体内容物是否是Ⅰ型IFN信号通路激活的原因。<br>　　方法:收集健康人血浆提取的MVs(MVcontrol)及脓毒症患者血浆提取的MVs(MVsepsis)，培养人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalendothelialcells，HUVECs)，应用激光共聚焦观察HUVECs对MVs的摄取。应用MVcontrol及MVsepsis同时干预HUVECs，分别采用Elisa及实时定量聚合酶链反应（quantitativereal-timepolymerisechainreaction，qRT-PCR）检测IL-8在细胞上清及细胞mRNA中的表达差异。应用超声粉碎MVsepsis携带的线粒体内容物，而后将超声干预前后的MVsepsis同时和HUVECs共孵育，采用qRT-PCR检测2′-5′寡腺苷酸合成酶2(2′-5′-oligoadenylatesynthetase2，OAS2)、自由基S-腺苷甲硫氨酸基结构域蛋白2(radicalS-adenosylmethioninedomaincontaining2，RSAD2)、趋化因子配体10(C-X-Cmotifchemokineligand10，CXCL10)三种Ⅰ型IFN信号基因的表达变化。应用流式细胞术及qRT-PCT检测MVcontrol及MVsepsis干预HUVECs后一氧化氮(Nitricoxide，NO)及一氧化氮合酶3(Nitricoxidesynthase3，NOS3)的表达变化。<br>　　结果:相较于MVcontrol，MVsepsis可导致HUVECs中IL-8的mRNA及其蛋白表达升高。其次，MVsepsis在和HUVECs共孵育后，流式分析显示，HUVECs的红色（mitoMVs被染后的颜色）荧光强度明显增高，激光共聚焦显示mitoMVs聚集到了细胞核周围。同时，同MVcontrol相比，MVsepsis可导致HUVECs中CXCL10、RSAD2及OAS2三种Ⅰ型IFN信号基因的表达升高，且以CXCL10的升高最为显著。应用超声破碎MVsepsis携带的线粒体内容物并和HUVECs共孵育后，流式分析HUVECs的红色荧光强度明显降低，激光共聚焦显示，mitoMVs聚集于HUVECs细胞核周围的数量明显减少，且qRT-PCR显示HUVECs中RSAD2、OAS2及CXCL10三种基因的表达显著降低。此外，同MVcontrol相比，虽然MVsepsis可导致胰岛素刺激的HUVECs中NO的释放和NOS3mRNA的表达降低，但没达到有统计学差异。<br>　　结论:MVsepsis能诱导血管内皮细胞发生炎症反应，且MVsepsis富含的线粒体内容物是血管内皮细胞Ⅰ型IFN信号激活的原因。