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摘要胰腺癌是常见消化道肿瘤之一，其起病隐匿，常因早期转移失去手术机会，预后较差。晚期胰腺癌治疗多以吉西他滨为代表的化疗为主，但多数患者对其耐药，疗效不佳。因此，寻找新的治疗方式并对之进行有效调控具有重要意义。<br>　　铁死亡是最近发现的一种新的细胞死亡方式，以铁代谢失衡和活性氧依赖为主要特点，已被证实参与了肿瘤等多种疾病的进程，对其进行有效调控以达到治疗肿瘤的目的已成为了最近研究的热点问题。然而，铁死亡在胰腺癌中的研究仍较少。<br>　　长链非编码RNA(Longnon-codingRNA，LncRNA)是一类不能翻译成蛋白的RNA，参与调控了肿瘤发生发展的多项进程，但其对铁死亡的调控目前仍研究较少。Alpha2巨球蛋白反义链RNA1(alpha-2-macroglobulinantisenseRNA1，A2M-AS1)是最近才被研究的一条LncRNA，被报道在胰腺癌中与生存明显相关，但其在胰腺癌中的具体作用机制仍不清楚。我们在前期的研究中发现，A2M-AS1在胰腺癌组织中表达量较癌旁组织显著下降，在予以铁死亡诱导剂Erastin诱导铁死亡后A2M-AS1表达量显著增加，提示A2M-AS1可能参与了胰腺癌发生发展的过程，且对胰腺癌细胞铁死亡可能具有调控作用，但具体机制仍需进一步探索。为探究以上问题，我们将进行以下研究:<br>　　目的:<br>　　1.探讨LncRNAA2M-AS1在胰腺癌组织的表达情况及与胰腺癌临床病理特征的关系。<br>　　2.通过在体外转染A2M-AS1过表达及沉默载体至人胰腺癌细胞株，探讨A2M-AS1对人胰腺癌细胞生物学功能的影响。<br>　　3.探讨A2M-AS1对人胰腺癌细胞铁死亡的影响。<br>　　4.通过A2M-AS1RNApull-down后质谱测序探究A2M-AS1直接结合的靶基因，探讨A2M-AS1靶向基因调控胰腺癌细胞铁死亡的分子机制。<br>　　方法:<br>　　1.购买来自上海芯超生物公司的胰腺癌组织芯片（含有80例胰腺癌及其癌旁组织、20例癌组织），行原位杂交（Insituhybridization，ISH）检测A2M-AS1在胰腺癌及癌旁组织中的表达水平，分析其与患者年龄、性别、病理分级、淋巴转移情况、吸烟史、饮酒史、糖尿病史、P53表达量、Ki-67表达量及生存时间的关系。<br>　　2.荧光原位杂交法(Fluorescenceinsituhybridization，FISH)检测A2M-AS1在胰腺癌细胞中的定位。比较人正常胰腺导管上皮细胞以及人胰腺癌细胞PANC-1、BxPC-3、AsPC-1中A2M-AS1的表达量，根据其表达情况选出进行过表达及沉默的人胰腺癌细胞株。构建A2M-AS1过表达及沉默病毒，分别转染至PANC-1细胞及BxPC-3细胞，qRT-PCR法检测PANC-1和BxPC-3细胞中各组A2M-AS1的表达情况;CCK-8及EdU检测PANC-1和BxPC-3细胞中各组的增殖活性;细胞克隆形成实验检测PANC-1和BxPC-3细胞中各组的克隆形成能力;划痕实验检测PANC-1和BxPC-3细胞中各组的迁移能力;Transwell法检测PANC-1和BxPC-3细胞中各组的侵袭能力。<br>　　3.将人胰腺癌细胞株予以不同浓度铁死亡诱导剂Erastin诱导铁死亡，qRT-PCR法检测A2M-AS1表达量变化。分别转染A2M-AS1过表达及干扰病毒后，予以铁死亡诱导剂Erastin诱导铁死亡，24h后CCK8法检测细胞死亡情况，生化试剂盒检测Fe2+、丙二醛(malonaldehyde，MDA)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)等铁死亡指标变化。将稳转OE-A2M-AS1及阴性对照的PANC-1细胞注入裸鼠皮下，并予以Erastin腹腔内注射，比较肿瘤大小、重量。<br>　　4.体外合成生物素A2M-AS1探针，与胰腺癌细胞裂解后的蛋白形成RNA-蛋白复合物，行质谱检验与A2M-AS1直接结合蛋白，GEPIA数据库检测其与A2M-AS1在胰腺癌中的相关性，选出相关性最强的基因PCBP3，并通过WesternBlot、RIP验证。构建PCBP3过表达及沉默病毒，分别转染至PANC-1细胞及BxPC-3细胞;沉默A2M-AS1后再转染PCBP3过表达病毒。予以Erastin诱导以上细胞铁死亡，24h后CCK8法检测细胞死亡情况，生化试剂盒检测Fe2+、MDA、GSH等铁死亡指标。<br>　　结果:<br>　　1.(1)ISH结果显示，A2M-AS1在胰腺癌中的表达水平明显低于癌旁组织;(2)A2M-AS1具有较好的胰腺癌诊断价值，其表达水平与患者年龄、性别、病理分级、淋巴转移情况、吸烟史、饮酒史、糖尿病史、ki-67表达量、P53表达量无明显相关性;(3)A2M-AS1表达量高的患者生存时间显著增加，可作为判断胰腺癌预后的生物标志物。<br>　　2.(1)FISH实验发现，A2M-AS1在胰腺癌细胞胞核、胞质中均有表达，但主要位于胞质。(2)qRT-PCR实验发现，PANC-1细胞中A2M-AS1表达量相对较低，故选择其转染A2M-AS1过表达病毒;BxPC-3细胞A2M-AS1表达量相对较高，选择其转染A2M-AS1沉默病毒。(3)转染A2M-AS1过表达载体后，PANC-1细胞中A2M-AS1表达量显著上升;转染A2M-AS1干扰病毒后，BxPC-3细胞中A2M-AS1表达量明显下降。(4)CCK-8及EdU实验发现，过表达A2M-AS1后，PANC-1细胞增殖活性显著下降，而沉默A2M-AS1后BxPC-3细胞增殖活性显著升高。(5)细胞克隆实验显示，过表达A2M-AS1后PANC-1细胞克隆形成能力明显下降，而沉默A2M-AS1后BxPC-3细胞克隆形成能力明显增加。(6)划痕试验显示，过表达A2M-AS1明显抑制了PANC-1细胞的迁移能力，沉默A2M-AS1后BxPC-3细胞迁移能力明显增加。(7)Transwell实验显示，过表达A2M-AS1后PANC-1细胞侵袭能力明显下降，沉默A2M-AS1后BxPC-3细胞侵袭能力显著增加。<br>　　3.(1)qRT-PCR实验显示，予以Erastin诱导PANC-1细胞及BxPC-3细胞铁死亡后，随着Erastin浓度增加，A2M-AS1的表达量呈明显上升趋势。(2)CCK-8结果显示，与对照组相比，Erastin干预后过表达A2M-AS1的PANC-1细胞存活率明显降低;与对照组相比，Erastin干预后沉默A2M-AS1的BxPC-3细胞存活率明显升高。(3)生化试剂盒检测发现，过表达A2M-AS1并诱导铁死亡后PANC-1细胞中Fe2+含量、MDA表达量明显增加，而铁死亡抑制分子GSH表达量显著下降;沉默A2M-AS1并诱导铁死亡后BxPC-3细胞中Fe2+含量、MDA表达量明显减少，GSH表达量显著升高。(4)体内实验显示，过表达A2M-AS1后肿瘤生长被显著抑制。予以Erastin治疗后，各组肿瘤体积、质量均明显减小，过表达A2M-AS1并予以Erastin治疗组体积最小。<br>　　4.(1)A2M-AS1RNApull-down后质谱实验发现，A2M-AS1正义链及反义链结合蛋白共有308个差异蛋白，其中122种蛋白与A2M-AS1直接结合的可能性较大（-101gP＞50）。(2)GEPIA数据库显示，以上结合可能性较大的蛋白中，40种蛋白与A2M-AS1在胰腺癌中呈明显正相关(P＜0.05)，其中PCBP3相关性最强(P=0)。(3)WesternBlot实验显示，A2M-AS1正义链结合蛋白中有PCBP3存在，而反义链结合蛋白中无PCBP3表达。(4)RIP实验显示，PCBP3结合的RNA中A2M-AS1的表达量与对照组相比明显增加，提示A2M-AS1与PCBP3有直接作用关系。(5)CCK-8实验显示，过表达PCBP3并诱导铁死亡后，细胞存活率明显下降;沉默A2M-AS1导致的铁死亡抑制被PCBP3过表达所逆转。(6)生化试剂盒检测结果显示，过表达PCBP3并诱导铁死亡后，细胞中Fe2+、MDA明显增加，GSH明显减少;沉默A2M-AS1导致的Fe2+、MDA减少，GSH增加被PCBP3过表达所逆转。<br>　　结论:<br>　　1.A2M-AS1在胰腺癌中表达量显著下降，且与患者生存时间呈正相关。<br>　　2.过表达A2M-AS1能显著抑制胰腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移及肿瘤生长，而沉默A2M-AS1显著促进胰腺癌细胞增殖、侵袭、迁移，提示A2M-AS1可能在胰腺癌的发生发展的过程中发挥着抑癌的作用。<br>　　3.A2M-AS1能促进胰腺癌细胞铁死亡的进程。<br>　　4.A2M-AS1可能通过靶向作用PCBP3调控胰腺癌细胞铁死亡。