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摘要固有免疫细胞在识别PAMPs和DAMPs，以及介导病原体和异常细胞的清除从而维持免疫稳态的过程中起着至关重要的作用。在巨噬细胞等固有免疫细胞的抗病毒免疫应答过程中，细胞的整体代谢状态会发生重塑，一系列代谢物小分子的合成水平产生变化，包括乳酸、衣康酸、精氨酸、琥珀酸等，这些代谢底物水平的变化往往影响了蛋白的翻译后修饰(PTM)，其中包括乙酰化、琥珀酰化等各类型的赖氨酸酰化修饰。研究表明，这些代谢分子水平的变化和PTM变化一方面有利于固有免疫细胞行使免疫功能，另一方面也有可能被病原体所利用，有助于其实现免疫逃逸。2019年，有研究报道巨噬细胞中存在组蛋白的乳酸化修饰，并且这种组蛋白修饰具有免疫负调节功能，但赖氨酸乳酸化修饰水平在病毒刺激巨噬细胞中的变化以及在抗病毒免疫应答中的功能性乳酸化修饰尚不清楚。随着质谱检测灵敏度的提高和蛋白质组学技术的进步，利用质谱分析各类别病理组织或细胞的蛋白质组，从大量的组学信息中挖掘关键的生理或病理机制成为了重要的研究策略，例如鉴定具有重要调控功能的蛋白质翻译后修饰位点，或者与临床数据结合筛选与疾病进展或预后相关的蛋白分子或翻译后修饰等。为了研究蛋白乳酸化修饰在病毒刺激活化巨噬细胞过程中的变化及调节机制，本课题进行了以下部分的研究:<br>　　一、发现VSV刺激条件下腹腔巨噬细胞蛋白质总体乳酸化上调<br>　　为了研究蛋白乳酸化修饰在抗病毒固有免疫应答中的作用，我们首先对小鼠腹腔巨噬细胞在VSV刺激条件下的乳酸化修饰变化水平进行检测，发现其在VSV刺激条件下存在乳酸化的整体性上调。加入乳酸脱氢酶抑制剂GNE-140和Oxamate能够下调腹腔巨噬细胞的乳酸化修饰，并增强在VSV刺激后的固有免疫应答水平。<br>　　二、发现小鼠腹腔巨噬细胞乳酸化修饰水平与年龄负相关<br>　　由于年轻小鼠和老年小鼠的糖酵解水平，即乳酸合成水平存在差异，我们检测了年轻小鼠和老年小鼠腹腔巨噬细胞的乳酸化修饰水平，我们发现腹腔巨噬细胞整体乳酸化修饰水平存在年龄相关性，老年小鼠腹腔巨噬细胞存在更低水平的乳酸化修饰水平。在VSV刺激条件下，老年小鼠，即低乳酸化修饰水平的巨噬细胞具有更强的固有免疫信号响应，而加入乳酸化抑制剂能够进一步增强固有免疫信号的响应，这一结果说明在病毒感染巨噬细胞的过程中，固有免疫信号的响应水平和干扰素转录水平与整体乳酸化修饰水平呈负相关关系，提示蛋白乳酸化修饰能够起到调控固有免疫应答过程的功能。<br>　　三、病毒刺激巨噬细胞的乳酸化修饰蛋白的鉴定<br>　　随后，利用蛋白质组学技术，我们对未经感染的小鼠腹腔巨噬细胞和VSV感染的小鼠腹腔巨噬细胞进行质谱蛋白质组检测，并通过来源于Maxquant和pFind的两种不同的算法分析其中的乳酸化修饰位点，在软件筛选结果的基础上，再通过质谱谱图的人工比对最终筛选保留了来源于25个蛋白的26个潜在的修饰位点。接下来，我们构建了这25个目标蛋白的Flag-基因重组质粒，并在HEK-293T细胞中转染过表达，经免疫沉淀实验，体外实验鉴定获得8个较为可靠的乳酸化修饰位点，包括GAPDH、PGK2、PPME1、STRAP、GPI、ALDOA、OXCT1以及MAPK3。随后，我们构建了这些乳酸化修饰蛋白的乳酸化修饰位点的点突变质粒，结果表明OXCT1、PPME1、STRAP、MAPK3、GAPDH这5个蛋白质分子的6个乳酸化修饰位点在突变为精氨酸后，其整体乳酸化修饰水平发生了下调。<br>　　四、乳酸化修饰蛋白的固有免疫调控机制的筛选<br>　　进一步地，为了研究这些鉴定得到的乳酸化修饰蛋白的固有免疫调控机制，我们构建了双荧光素酶报告基因体系，即通过修饰位点的点突变来研究这五个蛋白的乳酸化修饰位点对NF-Kb、ISRE、IFNα和IFNβ这四个天然免疫关键基因应答的调控关系。我们发现，这些乳酸化修饰对于天然免疫信号具有一定的调控作用。其中，最为显著的是，MAPK3(ERK1)的277位由赖氨酸突变为苏氨酸能够显著上调由IFNβ启动子转录的荧光素酶的表达、GAPDH的64位由赖氨酸突变为苏氨酸能够显著上调由ISRE、IFNα和IFNβ启动子转录的荧光素酶的表达。因此，我们聚焦于这两个位点作为接下来的研究目标。通过在293T细胞中过表达MAPK3蛋白，然后经免疫沉淀纯化的方法，我们通过质谱进一步鉴定了MAPK3的277位赖氨酸乳酸化的真实存在。而通过将277位赖氨酸突变为苏氨酸(K277T)来模仿乳酸化修饰的结果，MAPK3的277位由赖氨酸突变为苏氨酸能够显著上调由IFNβ启动子转录的荧光素酶的表达，这一结果进一步说明了乳酸化修饰对于IFNβ存在的调控作用。<br>　　五、赖氨酸乳酸化修饰酶的生物信息学分析<br>　　为了探究可能的乳酰基转移酶和去乳酰基转移酶，并指导后续实验的开展，我们选取来源于临床蛋白质组肿瘤分析协作组(CPTAC)数据库的肿瘤蛋白质组和乙酰化组质谱数据，通过生物信息学分析对潜在的酰基转移酶和去酰基化酶的乳酸化修饰调节潜力进行预测，预测结果显示EP300和KAT6A具有较高的概率具有乳酰基转移酶酶催化活性，HDAC3、HDAC4、HDAC5具有较高的概率具有去乳酰基转移酶催化活性。<br>　　综上所述，我们首先发现在VSV刺激条件下，腹腔巨噬细胞蛋白质总体乳酸化上调，并且小鼠腹腔巨噬细胞乳酸化修饰水平与年龄负相关，同时与固有免疫信号通路响应水平负相关。随后，我们利用蛋白质组质谱分析和分子生物学实验筛选和鉴定得到了6个乳酸化修饰位点。接下来，我们通过双荧光素酶报告基因实验筛选获得GAPDH和MAPK3这两个对固有免疫应答具有调控功能的乳酸化修饰蛋白。这些现象与结果说明非组蛋白的赖氨酸乳酸化修饰在巨噬细胞抗病毒固有免疫应答中具有重要的调控作用，并且确实存在具有重要调节固有免疫应答水平功能的乳酸化修饰蛋白。总而言之，本研究首次证实了巨噬细胞在病毒刺激条件存在总体乳酸化上调的现象，并且乳酸化修饰水平与固有免疫信号通路响应呈负相关关系。另外，我们还首次在非组蛋白中鉴定到了GAPDH和MAPK3这两个具有调节固有免疫应答水平功能的重要乳酸化修饰蛋白分子。本论文的研究结果将为进一步明确和完善赖氨酸乳酸化修饰在免疫细胞中的调节功能以及完善固有免疫应答的分子调控机制提供重要的实验依据，并为临床抗感染治疗提供新的干预思路。