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摘要木糖是一种戊糖，为五碳醛糖，是木聚糖的组分之一，广泛存在植物细胞内，也存在糖蛋白、动物肝素和软骨素中。目前游离的木糖还未在自然界中发现，木糖相关的糖缀合物已被发现具有重要的生物学价值，如作为植物及细菌的细胞壁及细胞外多糖组成成分，提供细胞间的联系功能，参与细胞间信号传导与交流、细胞增殖、肿瘤细胞生长等。在木糖糖缀合物的合成过程中，需要大量的木糖核苷酸作为糖基供体，UDP-木糖是生物体内常见的九种核苷酸糖之一，在生物体的生化合成中发挥着不可替代的作用。在生物体核苷酸糖合成通路中，UDP-木糖的合成途径主要是:木糖经过相关激酶的催化作用，产生UDP-木糖合成所需的底物Xy1-1-P，Xy1-1-P在木糖-1-磷酸胸苷转移酶的催化下与UTP反应而生成UDP-Xy1。工业中常用化学法合成UDP-Xy1，但此法存在一些缺点，如步骤复杂，产量较低，成本较高等。用生物酶法方法合成UDP-Xy1具有操作简单、产物纯、成本低、产量高、对环境友好的优势，而采用这种方法需要具有高性能的生物酶。目前对上述通路中所需的木糖-1-磷酸胸苷转移酶的研究较少，本论文以Xy1-1-P到UDP-Xy1的合成通路中所需的糖-1-磷酸核苷转移酶为研究对象，挖掘具有高性能的木糖-1-磷酸胸苷转移酶并研究其活性特点及蛋白结构。<br>　　本论文从Terriglobus roseus菌株中发现了拟葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶的基因，通过基因克隆、载体构建和体外诱导表达，获得了具有活性的酶，经过活性测定，发现其具有为木糖-1-磷酸胸苷转移酶的活性。接下来，对该酶的最适pH、最适温度等反应条件进行了研究，同时为了解释其催化机理，对其进行了蛋白结晶的条件筛选以培养合适的蛋白晶体，并对其三级结构进行了解析。具体研究内容如下:<br>　　1.新型木糖-1-磷酸胸苷转移酶Tr0678的基因克隆、重组表达、纯化及活性测定研究<br>　　通过生物信息学序列比对，本研究从酸杆菌门的Terriglobus roseus(DSM18391)中发现了编码葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶的基因:Tr0678。通过设计引物、PCR扩增、载体构建，获得了重组拟葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶的基因片段。将重组拟葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶质粒导入到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)细胞中在18℃进行IPTG诱导表达，并使用镍亲和层析柱(Ni-NTA)对所得的带有组氨酸标签的重组拟葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶进行了分离和纯化。经凝胶电泳SDS-PAGE分析，结果显示，得到了纯度较高的目的蛋白的单一条带，且条带大小与理论分子量33kDa基本一致。采取改良型的Bradford蛋白浓度测定试剂盒对其蛋白浓度进行了测定，得到纯化后的拟葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶Tr0678的实际蛋白浓度为3.3573±0.25mg/mL。<br>　　为了确定拟葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶的活性，以相关糖一磷酸包括Xy1-1-P作为底物，在反应体系中加入UTP，37℃进行反应，将反应结束后的上清液，使用液相质谱联用仪对反应产物进行检测。根据色谱条带及质谱峰图，初步判断Tr0678具有相关活性，通过分子量的大小，确定产物为UDP-Xy1，即Tr0678对Xy1-1-P有明显活性，确定其具有木糖-1-磷酸胸苷转移酶的活性。接下来，本研究继续以Xy1-1-P为底物，利用已经建立的LC-MS检测法，对该木糖-1-磷酸胸苷转移酶的基本酶学特性进行了研究。结果表明:该酶的最适反应pH条件为8.0，最适反应温度条件为50℃，且在37-50℃之间能保持较高活性。<br>　　2.新型木糖-1-磷酸胸苷转移酶的活性位点、蛋白结晶条件筛选及结构解析研究<br>　　选取具有类似功能的糖-1-磷酸核苷酰转移酶基因序列，通过同源蛋白序列比对，将其中的保守位点第108位天冬氨酸进行定点突变，使其突变成丙氨酸及天冬酰胺，通过比较对突变体与野生型Tr0678的相对酶活力，发现对位于第108位的天冬氨酸突变后，其相对酶活性几乎丧失。因此判断Asp108是影响Tr0678木糖-1-磷酸胸苷转移酶催化活力的关键氨基酸。<br>　　通过对Tr0678蛋白的大量表达与纯化，得到了纯度较高的蛋白溶液，并通过结晶条件的初步筛选，在pH为5.0的0.1M柠檬酸缓冲液，沉淀剂为20％(v/v)及PEG6000条件下获得了突变型蛋白晶体。在野生型蛋白初筛条件的基础上，更换蛋白缓冲液为pH为6.5的柠檬酸-硫酸钠缓冲液，并通过降低浓度进行优化，获得了优化的野生型蛋白晶体。通过添加1％的底物，将野生型及突变型Tr0678与底物进行共结晶，获得了复合物晶体。经X光衍射蛋白晶体分辨率为2.65(A)。收集整理衍射数据并进行分析，解析出了Tr0678的蛋白结构，以该结构为模板预测了突变体与底物复合物的结构。结果发现该蛋白的一个活性单元为该蛋白的一个二聚体，两个蛋白分子以“头尾相对”方式结合。对于该酶的催化机制还有待进一步的研究。