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摘要肺炎克雷伯菌（Klebsiellapneumoniae）是一种能引起严重社区感染和院内感染的革兰阴性菌，这种肠杆菌的主要特点是产气，有荚膜，且不能游动。肺炎克雷伯菌容易定植在人体黏膜表面，包括鼻咽部和胃肠道，当人体免疫能力降低时，病原菌从这些地方进入其它组织，引起肺炎、菌血症等。肺炎克雷伯菌在定植肠道的过程中，需要克服多重肠道环境压力，其中包括由肝细胞合成并分泌到小肠的胆汁。胆盐(Bilesalts)是胆汁的重要组成部分，胆盐作为一种抗菌剂，能对细菌造成多重损害，肠道病原菌在进化过程中为了能更好的定植在肠道，都发展出一定的胆盐耐受机制。目前肺炎克雷伯菌抗胆盐的机制还不清楚。研究病原菌耐胆盐机制有助于了解影响细菌肠道定植的关键因子，可为病原菌治疗提供一定的理论基础。<br>　　本研究检测了30株临床分离的肺炎克雷伯菌对粗胆盐(Crudebile)的耐受度，发现有28株的粗胆盐耐受浓度为4％及以上。为探究肺炎克雷伯菌对胆盐的耐受机制，通过构建转座子突变文库，从5个文库里约10000株突变体中筛选到4株对粗胆盐敏感的突变株，经测序发现，转座子分别插在了acrA、acrB、nlpD、ruvB四个基因上，其中多药外排泵acrA和acrB具有转运多种抗菌物质的作用，因此选择acrA和acrB进一步研究其对肺炎克雷伯菌胆盐耐受性的影响。利用同源重组的方法构建了多药外排泵acrA和acrB的插入失活株，在体外实验条件下，检验突变株对粗胆盐的敏感程度。研究发现，处于不同生长时期的突变株ΔacrA和ΔacrB经0.5％的胆盐处理一小时后，存活率最高分别为9.9％和3.4％，ΔacrA和ΔacrB缺失株在胆酸钠(Cholatesodium)，牛磺胆酸钠(Sodiumtaurocholate)，脱氧胆酸钠(Deoxidizationcholate)三种不同的胆盐中生长都被抑制，说明外排泵可外排不同种类的胆盐。此外，由于AcrA和AcrB可介导多种物质的外排，本文还检测了ΔacrA和ΔacrB对SDS和部分抗生素的敏感性，结果发现，肺炎克雷伯菌缺失外排泵acrA或acrB导致对SDS、四环素、氯霉素、利福平、壮观霉素的敏感度升高。<br>　　为了进一步探究AcrB介导胆盐外排的关键位点，本文构建了基因acrB的完整回补菌株和缺失acrBG环上第615、616、617、618位氨基酸残基后的回补菌株。实验发现，完整的回补菌株的胆盐耐受度能够回复到野生型水平，而缺失第615、616、617、618位氨基酸残基的回朴株只能恢复部分胆盐耐受度。说明AcrB中第615、616、617、618位氨基酸中可能存在介导胆盐耐药性的关键位点。<br>　　最后，为了研究外排泵acrA和acrB基因对肺炎克雷伯菌在小鼠体内定植能力的影响，首先利用成年鼠和MurineExvivoAnaerobicTissue(M-E-A-T)模型进行研究。成年鼠肠道竞争性定植实验发现，ΔacrA和ΔacrB在肠道内的定植能力显著低于野生型，随着定植天数的延长，缺失株和WT的差异可达10000倍。“M-E-A-T”模型中，ΔacrA和ΔacrB在小肠中的存活能力显著低于野生型，而在大肠中的存活没有差异，推测这种现象是由于小肠中胆盐浓度较高而大肠中胆盐浓度低造成的。此外，大蜡螟(Galleriamellonella)模型的毒力检测表明，ΔacrA和ΔacrB缺失株的毒力和野生型相比减弱，导致大蜡螟存活率提高。由于生物膜形成能力能够在一定程度上反映菌株的毒力，因此进一步检测了菌株的生物膜，发现缺失acrA或acrB并不影响菌株的生物膜，说明缺失株ΔacrA和ΔacrB毒力的降低并不是生物膜造成的。<br>　　肺炎克雷伯菌对胆盐的耐受性是其能够定植于肠道的关键，本文研究表明，外排泵acrA、acrB基因对肺炎克雷伯菌抵抗胆盐进而定植在小肠中具有重要的调节作用。