单分子荧光共振能量转移技术平台的搭建与应用-论文-万方医学网

单分子荧光共振能量转移技术平台的搭建与应用

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摘要很多生物学反应都非常复杂，传统的宏观检测技术并不能完全发现其内在的反应规律。本质上说来，所有的生物学反应都是通过单个的酶、DNA或RNA分子起作用。对单个生物大分子进行研究，能够清晰的观测到单个生物大分子是如何行使其生物学功能的。<br>　　单分子技术方法主要有两大类，一种是荧光威像及其光谱学的方法，另一种是基于力学的方法。基于荧光成像的方法有离体和在体两种，基于力学的单分子技术方法主要包括光镊、磁镊、原子力显微镜以及纳米孔等。其中，单分子荧光共振能量转移检测技术是研究生物学事件的非常有力的工具。与全体效应下的FRET测量不同，全体效应下的FRET很难让生物分子的构象改变同步变化，也无法检测到短暂存在的构象体，单分子荧光共振能量转移技术能够确定几种构象的分布，还能够直接观测到短暂存在的结构状态。<br>　　本文详细介绍了建立在全内反射荧光显微镜基础上的单分子荧光共振能量转移技术。首先介绍了单分子荧光共振能量转移技术的原理，包括全内反射激发原理、能量共振转移原理、样品玻片表面固定原理。其次介绍了我们如何准备样品通道以及搭建仪器硬件平台，样品通道的准备有三条技术路线，硬件平台我们搭建在奥林巴斯的荧光倒置显微镜上，为了方便样品加样，我们还设计了专门的加样平台。再次介绍了我们使用ImageJ、IDL以及MATLAB软件对数据的处理方式，包括数据采集、噪声去除、找点定位、数据提取、数据可视化。最后我们实例介绍了利用单分子荧光共振能量转移技术研究Ded1解螺旋酶蛋白与核酸的相互作用，我们发现ATP非水解类似物AMP-PNP并不能够促进RNA解螺旋酶解开DNA-RNA杂交核酸双链结构。