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摘要据中国肿瘤管理中心统计的相关数据得知，近年我国恶性肿瘤的发病率和死亡率不断攀升，目前恶性肿瘤的治疗仍任重道远。恶性肿瘤的传统治疗方式为手术、放疗和化疗。近年来，新兴的肿瘤免疫疗法蓬勃发展。这种疗法不仅能有效清除肿瘤，而且还避免了对机体的损伤，因此近年来备受关注。在众多免疫疗法中，肿瘤疫苗极具潜力，是治疗肿瘤的优质选择。前期工作中我们通过mRNA芯片技术检测4个白血病患者的骨髓标本和4个健康志愿者骨髓标本，高通量筛选白血病相关基因，发现表皮生长因子受体通路底物8(EpidermalGrowthFactorReceptorPathwaySubstrate8，Eps8)是在初发型白血病患者细胞显著高表达的mRNAs之一;提示Eps8可能作为肿瘤疫苗的新靶点，因此我们将以人Eps8为靶点进一步构建多肽疫苗，其中的抗原肽段包含了抗原表位的氨基酸序列，可以通过化学合成进行制备，技术安全，标准化程度高，安全性好，更有利于临床转化。<br>　　本课题提出以自主研发的抗原表位肽疫苗为基础，同时联合PD-1抗体，针对肿瘤多肽疫苗的缺陷，结合新型疫苗载体，治疗复发难治白血病的设想，为白血病的清除提供了新思路。<br>　　第一章 以Eps8为靶点的HLA-A*2402限制性表位肽的筛选和鉴定<br>　　目的:<br>　　筛选以新型肿瘤抗原Eps8为靶点的HLA-A*2402限制性多肽，体外和体内实验验证其免疫原性，为今后多肽疫苗的构建和应用提供一定基础。<br>　　方法:<br>　　1.使用生物信息学软件对Eps8氨基酸序列进行预测打分，综合BIMAS和SYFPEITH软件的打分进行排名，选出排名前四的HLA-A*2402限制性的候选表位;<br>　　2.利用分子模拟软件Autodock4.2对接HLA-A*2402分子和候选表位肽，评价HLA-A*2402分子和候选表位肽的空间对接能力;<br>　　3.ELISPOT检测候选肽诱导HLA-A*2402阳性健康成人志愿者和肿瘤患者T细胞分泌IFN-γ的能力;<br>　　4.MHC四聚体技术检测候选肽分泌的特异性T细胞的频率;<br>　　5.LDH杀伤法检测候选肽对HLA-A*2402和Eps8表达双阳性的不同肿瘤细胞的杀伤作用;<br>　　6.胞内因子染色实验检测诱导的特异性CD8+CTL分泌IFN-γ和上调CD69的能力;<br>　　7.ELISA检测候选肽和肿瘤细胞共孵育后分泌的穿孔素、颗粒酶B和FASL水平;<br>　　8.检测肽诱导的特异性CTL对荷瘤裸鼠的抑瘤作用。<br>　　结果:<br>　　1.根据SYFPEITHI和BIMAS软件的结果，筛选出分值在2个软件中打分靠前的HLA-A*2402限制性表位肽p327，534，334和755;<br>　　2.Autodock对接结果显示p327，534，334和755均和HLA-A24分子结合，对接稳定;<br>　　3.ELISPOT实验表明p327，534和755在HLA-A*2402+供者中刺激产生了能分泌高水平IFN-γ的CTL;<br>　　4.LDH杀伤实验表明p327，534，755诱导的CTL能有效杀伤高表达Eps8、HLA-A*2402阳性的肿瘤细胞，当下调这些细胞Eps8的表达后，CTL的杀伤作用显著减弱;<br>　　5.胞内因子染色实验表明这p327，534，755肽均能很好的促进CD8+CTL释放IFN-γ和上调CD69;<br>　　6.ELISA实验表明p327，534，755肽诱导的T细胞相较无肽刺激组分泌的IL-2和TNF-α显著增多.<br>　　结论:<br>　　本实验利用体外和体内免疫学实验展示了p327，534，755候选肽的免疫原性，结果显示p327，534，755肽能有效诱导产生肽特异性CTL，进一步能够识别和裂解Eps8+HLA-A*2402+双阳性的靶细胞。目前肿瘤多肽疫苗的研发是国内外探索热点，而进一步提高肿瘤疫苗的免疫原性是加强疫苗效果的关键。<br>　　第二章 新型Eps8表位肽靶向Eps8/EGFR的抗肿瘤作用研究<br>　　目的:<br>　　根据上述筛选出的新型Eps8表位肽，探讨其作为多肽抑制剂阻断Eps8与EGFR近膜区的结合的可能性，从而下调EGFR下游促瘤信号，进而抑制肿瘤细胞增殖、转移、侵袭，促进凋亡。<br>　　方法:<br>　　1.靶向Eps8/EGFR多肽抑制剂的设计及合成，同时构建随机对照肽;<br>　　2.CCK-8法、平板克隆法、流式细胞术、划痕实验、transwell迁移实验检测多肽抑制剂p327体外抑制肿瘤细胞增殖和迁移，促进凋亡的能力;<br>　　3.免疫共沉淀法分析多肽抑制剂p327对Eps8/EGFR复合物的阻断作用;<br>　　4.WesternBlot进一步分析多肽抑制剂对EGFR通路蛋白的影响;<br>　　5.加入TAT穿膜序列进一步构建穿膜能力更强的新型多肽抑制TAT-327，流式细胞术和激光共聚焦实验检测FITC标记的p327和TAT-327进入肿瘤细胞的能力;<br>　　6.利用CCK-8法、平板克隆形成、流式细胞术、transwell小室等实验方法检测TAT-327对肿瘤细胞增殖、凋亡、细胞周期及侵袭能力的影响。<br>　　结果:<br>　　1.体外实验验证多肽p327能够抑制肿瘤细胞增殖和迁移;<br>　　2.免疫共沉淀法验证p327对Eps8/EGFR复合物具有阻断作用;<br>　　3.流式细胞术和激光共聚焦实验表明FITC标记的p327和TAT-327均能够进入肿瘤细胞;TAT-327的穿膜效率更高;<br>　　4.WesternBlot表明p327和TAT-327能够下调EGFR信号通路;TAT-327能够更显著地抑制EGFR下游通路;<br>　　5.小鼠体内抑瘤实验验证多肽TAT-327更有效地抑制肿瘤细胞体内生长。<br>　　结论:<br>　　本研究验证了多肽p327可作为多肽抑制剂阻断Eps8和EGFR近膜区的结合，可在体外和体内直接抑制肿瘤的生长和迁移等生物活性，并阐明了p327杀伤肿瘤细胞的作用机制。此外，为了增加多肽327的肿瘤杀伤作用，加入TAT穿膜序列构建穿膜能力更强的多肽TAT-327，功能学免疫实验和分子机制学实验验证TAT-327的抑瘤作用，为靶向Eps8的肿瘤个体化治疗提供实验依据。<br>　　第三章 基于自愈合微球的新型肿瘤疫苗用于清除白血病的研究<br>　　目的:<br>　　本课题所使用的新型微球安全性良好、可用性强、佐剂效果良好、制备工艺简单、易于放大生产，能使构建的新型疫苗尽快进入临床试验阶段，有助于加速临床转化。本实验拟借助项目合作团队前期研发的新型多孔自愈合微球在抗原肽装载、调控注射微环境、共装载免疫激活剂等方面的独特优势，构建负载Eps8多肽和PD-1抗体的自愈合微球疫苗。从细胞株、临床标本、人源化小鼠模型等层面:①明确新型自愈合微球疫苗对白血病治疗的安全性和有效性;②分析新型自愈合微球疫苗在注射局部对APC募集和活化、抗原释放和摄取、胞内交叉提呈等的调节和强化作用;③验证新型自愈合微球疫苗对CD8+T细胞增殖和杀伤能力的增强作用，以及对细胞因子分泌的调节作用，证实疫苗对白血病的清除作用，为难治复发白血病的治疗提供新靶点和新策略。<br>　　方法:<br>　　1.构建负载Eps8表位肽和PD-1单抗的自愈合微球疫苗;<br>　　2.扫描电镜(SEM)表征愈合前后微球的形貌;采用激光共聚焦技术荧光标记多肽和单抗在微球内的分布;建立持续体外流动释放系统，释放介质，间歇收集释放液，计算药物累计释放量及百分比;<br>　　3.观察体内疫苗制剂的代谢动力学;<br>　　4.观察疫苗注射部位的炎症反应，监测注射部位组织蛋白含量和趋化因子含量，分析不同抗原递呈细胞的抗原利用率;<br>　　5.观察免疫小鼠淋巴结中APC归巢和T细胞增殖情况;<br>　　6.考察免疫小鼠脾脏T细胞增殖、活化、对肿瘤细胞的杀伤作用;<br>　　7.评价新型疫苗制剂对人源化白血病小鼠的治疗作用。<br>　　结果:<br>　　1.成功构建负载Eps8表位肽和PD-1单抗的自愈合微球疫苗，用相应方法表征;<br>　　2.自愈合微球疫苗具有一定的抗原储库效应;<br>　　3.自愈合微球疫苗对炎症细胞具有募集行为，能够显著提高趋化因子的表达，可以更有效地调控抗原释放与细胞募集行为，使两者协同作用，进一步提升抗原的利用率;<br>　　4.自愈合微球组中淋巴结募集DC和巨噬细胞的能力显著加强，从而利于后续T细胞的活化;<br>　　5.自愈合PLA微球疫苗能诱导小鼠脾淋巴细胞分泌高水平IFN-γ，同时对Eps8和HLA-A2双阳性的血液肿瘤细胞具有明显的杀伤作用;<br>　　6.自愈合PLA微球疫苗对人源化白血病小鼠具有治疗作用，能显著延长小鼠的生存期。<br>　　结论:<br>　　本项目合作团队成功制备出尺寸均一、多孔自愈合的PLA微球，融合了生物化工、材料化工、肿瘤生物学等多学科交叉的研究方式，从分子、细胞和动物等不同水平上，揭示微球疫苗性质与肿瘤疾病的关系。本研究利用后包埋法制备出了表面多孔、内部贯穿结构的多孔聚乳酸微球，进一步利用其在温和的加热条件下(38-40℃)表面多孔可自愈合的特点，加入Eps8表位肽和PD-1单抗构建新型自愈合微球疫苗。研究了自愈合微球疫苗对抗原的装载与释放的影响以及在注射部位对炎症细胞，趋化因子的募集作用。利用不同的人源化白血病小鼠模型验证了微球疫苗的抗白血病作用。