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摘要背景:系统性红斑狼疮(SLE)患者巨噬细胞(Mφ)吞噬凋亡细胞(ACs)的能力存在缺陷，导致ACs在体内堆积，进而发生继发性坏死，自身抗原暴露，最终导致免疫耐受的打破和多种组织器官的损害。间充质干细胞(MSCs)移植治疗SLE取得较好疗效。我们前期研究发现MSCs移植可以显著减少SLE患者体内凋亡T细胞的数量，并增强SLEMφ的吞噬功能，但MSCs对ACs的吞噬作用及其在治疗SLE中所起的作用尚不完全清楚。<br>　　目的:本课题旨在研究MSCs对ACs的吞噬作用，深入探讨吞噬ACs后的MSCs(AC-MSCs)免疫抑制功能的变化及其治疗SLE模型小鼠的疗效，揭示MSCs吞噬ACs在治疗SLE中的作用和机制。<br>　　方法:将人脐带(UC)MSCs与ACs共培养，利用流式细胞术(FCM)以及激光共聚焦显微镜分别检测和观察体外MSCs对ACs的吞噬作用。将不同荧光标记的ACs和MSCs注射至小鼠腹腔，观察MSCs体内吞噬ACs。利用重组膜联蛋白Ⅴ(AnnexinⅤ)封闭ACs表面磷脂酰丝氨酸(PS)，或小干扰RNA(siRNA)沉默MSCs中乳脂球表皮生长因子8(MFG-E8)的表达，以探讨介导MSCs吞噬ACs的分子机制。FCM检测SLE患者和pristane诱导狼疮鼠骨髓(BM)MSCs吞噬ACs的能力是否存在缺陷。对比MSCs和AC-MSCs对健康志愿者(HC)CD4+T细胞增殖的抑制作用;进一步以MSCs条件培养基(MCM)及AC-MSCs条件培养基(ACMCM)培养HC外周血单个核细胞(PBMCs)，对比其对CD4+T细胞增殖的抑制作用，从而明确可溶性因子是否介导了AC-MSCs免疫抑制功能的变化。酶联免疫吸附法(ELISA)检测MSCs和AC-MSCs培养上清以及小鼠腹腔灌洗液(PLF)中的前列腺素E2(PGE2)等因子的水平，实时荧光定量聚合酶链反应(realtimePCR)和蛋白免疫印迹法(WB)检测AC-MSCs中介导PGE2产生的环氧合酶2(COX2)的表达。在MSCs和ACs共培养体系中加入COX2的抑制剂或利用siRNA沉默COX2，观察ACMCM对CD4+T细胞增殖的抑制作用是否被逆转，从而明确COX2/PGE2在AC-MSCs免疫抑制功能变化中的作用。此外，利用WB研究介导AC-MSCs中COX2/PGE2活化的相关信号通路。ELISA检测SLE患者MSCs移植前后血浆中PGE代谢产物(PGEM)的水平。分别将MSCs、AC-MSCs及相对应的COX2沉默的MSCs和AC-MSCs通过尾静脉注射给MRL/lpr小鼠，观察其对狼疮病情的改善作用。<br>　　结果:我们发现MSCs体内外均可吞噬ACs。封闭PS以及沉默MFG-E8均显著减少MSCs对ACs的吞噬。此外，SLE患者及狼疮鼠BM-MSCs吞噬能力均明显受损。与MSCs相比，AC-MSCs的免疫抑制能力显著增强;MCM不能抑制CD4+T细胞的增殖，而ACMCM则显著抑制CD4+T细胞的增殖。AC-MSCs培养上清中PGE2的水平显著升高;同样，MSCs体内吞噬ACs后PLF中PGE2水平也明显提高。AC-MSCs中COX2的基因表达水平和蛋白表达水平均显著增加。COX2抑制以及siRNA沉默实验证实AC-MSCs通过COX2/PGE2增强其免疫抑制能力;进一步的信号通路研究发现COX2/PGE2的活化是由Rac1和NF-kB通路介导的。在SLE患者中，移植MSCs后外周血凋亡T细胞显著减少的患者，其血浆PGEM的水平较移植前相比明显升高。不同处理的MSCs体内移植治疗MRL/lpr小鼠8周后，发现AC-MSCs移植治疗组狼疮鼠生存率显著高于PBS组。AC-MSCs移植小鼠尿蛋白水平早在移植后1周与PBS组相比就显著下降。AC-MSCs组小鼠血清抗dsDNA抗体水平、脾脏和肾脏引流淋巴结浆细胞数量均显著低于PBS组。AC-MSCs及MSCs组小鼠肾脏IgG和C3沉积均明显减少，肾脏CD206+Mφ百分率升高;而COX2沉默的MSCs和AC-MSCs不能有效改善肾脏病理损伤和减少肾脏IgG及C3的沉积，也不能上调肾脏CD206+Mφ。<br>　　结论:MSCs吞噬ACs是其减少SLE体内ACs数量的机制之一;MSCs吞噬ACs后可通过增加PGE2分泌进而增强其免疫抑制功能，发挥治疗作用。本研究为临床开展MSCs移植治疗SLE新技术提供理论依据。