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摘要背景:系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus，SLE)为经典的自身免疫病原型，发病机制尚不清楚，目前仍缺乏安全有效的治疗方法。本课题组前期发现，SLE患者骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)功能存在异常，可能参与其发病，机制尚不清楚。异基因MSCs移植(MSCstransplantation，MSCT)治疗SLE已被证实安全有效。MSCs功能受多种因素调节，近年研究发现微小RNAs(microRNAs，miRNAs)参与MSCs功能的调控。<br>　　miRNAs为长约19-25碱基的非编码单链小RNA，通过与其靶基因mRNA的3''-非编码区(3''-untranlatedregions，3''-UTR)不完全互补配对，降解靶基因mRNA或抑制其翻译过程，从而参与细胞生长、发育等调控，其表达及功能失调与多种疾病的发生相关。目前尚无学者从miRNAs角度揭示SLE骨髓MSCs功能异常的机制。<br>　　目的:本研究筛选了SLE患者骨髓MSCs异常表达的miRNAs种类，分析其与临床谱的相关性;体外探讨miR-663对骨髓MSCs功能的影响及调控机制，并通过狼疮鼠模型进一步探讨miR-663对骨髓MSCs功能及疗效的调控。<br>　　方法:细胞贴壁法成功培养健康人及SLE患者骨髓MSCs，酶消化法收集第四代(passage4，P4)MSCs，流式细胞术(flowcytometry,FCM)鉴定培养骨髓MSCs表型及纯度，miRNAs表达谱芯片技术检测194种SLE相关成熟miRNAs在健康人及SLE患者骨髓MSCs中表达水平差异，应用分层聚类分析筛选SLE骨髓MSCs异常表达miRNAs种类，实时荧光定量聚合酶链反应(quantitativerealtimepolymerasechainreaction，qRT-PCR)验证芯片筛选miRNAs在SLE患者骨髓MSCs中的异常表达，分析其与临床谱的相关性。人工转染miR-663-negative-control(miR-663-C)、mimics-miR-663(miR-663-M)及inhibitor-miR-663（miR-663-I）真核细胞表达载体至健康入骨髓MSCs，以未转染骨髓MSCs为对照组(miR-663-N)，分别测其增殖、迁移、凋亡及免疫调节等功能，具体为:CFSE法检测其增殖功能，trans-well体系检测其迁移功能，AnnexinⅤ/7-AAD双染色法检测其凋亡率，并将MSCs与外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs）1∶10共培养3天后，FCM检测辅助性T细胞1(helperTcells1，Th1)、Th2、Th17、调节性T细胞(regulatoryTcells,Treg)及滤泡辅助T细胞(follicularTcells,Tfh)等免疫细胞比率，以测其免疫调节功能。生物信息学分析预测miR-663靶点，并对靶基因进行功能分析，发现转化生长因子-β1（transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1）为其重要预测靶点，qRT-PCR法检测健康人和SLE患者骨髓MSCs中TGF-β1mRNA表达，酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)检测血清及共培养上清中总TGF-β1及活化TGF-β1蛋白表达水平，人工干扰TGF-β1通路后，检测miR-663对骨髓MSCs功能影响。构建TGF-β1mRNA表达载体，通过双荧光素酶报告基因实验直接验证其靶点。蛋白免疫印迹法(westernblot，WB)检测miR-663相关载体转染后MSCs内信号通路蛋白分子（Smad2/3、Akt、p38/MAPK等）变化，阻断信号通路后，检测MSCs功能变化，以明确miR-663调控MSCs的具体信号通路。红色荧光燃料PKH26标记的miR-663-C、miR-663-M及miR-663-I真核细胞表达载体转染入骨髓MSCs并输注16周龄MRL/lpr小鼠体内，以PKH26标记骨髓MSCs治疗组为对照组，24h及72h后，检测MSCs体内归巢能力变化。分别转染有miR-663相关载体的骨髓MSCs尾静脉输注16周龄MRL/lpr小鼠，以未转染骨髓MSCs(non-transfection)治疗组及滑膜成纤维细胞(fibrolast-likesynoviocytes，FLS)治疗组为对照组，8周后，ELISA法检测外周血免疫球蛋白(immunoglobulin，IgG)、抗双链DNA抗体(anti-doublestrandedDNAantibody,Anti-ds-DNA)及抗核抗体(antinuclearantibody,ANA)水平，考马斯蓝染色（coomassiebluestaining,CBS）法检测尿蛋白浓度，苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosinstaining,HE染色）观察肾脏病理，免疫荧光法检测IgG、补体3(complement3，C3)等免疫复合物在肾脏中沉积水平，FCM法检测小鼠脾脏单个核细胞(mononuclearcell,MCs)中Th1、Th17、Treg及Tfh等免疫细胞比率，并检测小鼠骨髓MSCs增殖、迁移等功能变化。<br>　　结果:SLE患者骨髓MSCs中存在多种异常表达的miRNAs，其中异常高表达miRNAs:hsa-miR-27b_st,hsa-miR-374a_st,hsa-miR-638_st,hsa-miR-663_st,hsa-miR-502-3p_st,hsa-miR-214_st,hsa-miR-744-3p_st,hsa-miR-99b-star_st,hsa-miR-423-3p_st,hsa-miR-574-3p_st;异常低表达miRNAs:hsa-let-7a_st，hsa-let-7f_st，hsa-let-27b_st，hsa-miR-374a-star_st。miR-663表达与CRP、SLEDAI评分正相关，与C3负相关，但与C4、Cr、BUN无显著相关性，而miR-638表达与CRP、SLEDAI评分正相关。miR-663可降低健康人骨髓MSCs增殖、迁移率，增加其晚期凋亡率，且MSCs与PBMCs共培养时(1∶10)，与miR-663-C组相比，miR-663-M转染组MSCs不能有效上调Treg百分率，且不能有效降低Tfh百分率，而miR-663-I组效果相反。进一步实验证实，这一过程可能通过降低CD4+CD25+T细胞增殖率，抑制CD4+CD25-T分化为Treg，促进na(i)veCD4+T细胞分化为Tfh发挥作用，而对Th1、Th2及Th17等免疫细胞无明显调节作用。相对于健康人，TGF-β1mRNA在SLE患者MSCs中低表达，且miR-663转染可逆转MSCs中TGF-β1mRNA表达及MSCs分泌TGF-β1水平。WB等研究提示，TGF-β1活化Akt、p38/MAPK信号通路介导了miR-663对MSCs迁移及免疫调节功能的影响。荧光素酶报告基因证实miR-663调控MSCs免疫调节等功能是通过直接靶向TGF-β1mRNA实现。与miR-663-C及miR-663-M组相比，miR-663-I转染可增强骨髓MSCs体内归巢能力，提高MSCs治疗MRL/lpr小鼠疗效，表现为脾脏及淋巴结显著变小，外周血总IgG及显著降低，ANA水平及蛋白尿浓度有下降趋势，肾脏病理及免疫复合物沉积有所改善，且MSCT可扭转MRL/lpr小鼠中TGF-β1异常表达水平，对MRL/lpr小鼠骨髓MSCs增殖及迁移功能也有一定修复作用。<br>　　结论:SLE患者骨髓MSCs中存在多种异常表达的miRNAs，其中以miR-663异常表达最为显著，且miR-663水平与SLE患者临床谱显著相关。miR-663通过靶向TGF-β1影响SLE患者骨髓MSCs免疫调节等功能，这可能参与SLE发病，也可能是SLE患者自体骨髓MSCT疗效不佳的原因之一。抑制miR-663表达可增强骨髓MSCs体内归巢能力，提高MSCT对MRL/lpr小鼠疗效。