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摘要背景及目的意义:<br>　　本论文通过4个部分研究了IL-27Rα在同种移植急性排斥中的作用、分子机制及作为体内移植物急性排斥生物学标志的意义。论文首先对同种移植小鼠模型IL-27Rα及IL-27的表达及细胞定位进行了研究，探讨其在同种移植排斥中的作用;第二部分研究了IL-27Rα细胞信号通路激活后引起的下游分子改变，探讨其作用的分子机理和细胞信号通路;第三部分针对其在急性排斥期移植物高表达的特点，制备了靶向IL-27Rα的放射性核素标记单抗分子探针，通过在体全身动态磷屏自显影显像及靶向性分析，研究其是否可作为早期提示移植物急性排斥的发生的特异性生物学标志;第四部分，利用基因重组IL-27(recombinant IL-27，rIL-27)，制备了靶向IL-27Rα的小分子受体显像探针，研究其体内靶向同种排斥移植物的能力及特征。本论文研究结果为阐明IL-27Rα在同种移植排斥中作用及分子机制提供了重要实验依据，对利用核素分子显像在体靶向IL-27Rα监测同种移植物急性排斥提供了新的策略，对靶向IL-27Rα诱导同种移植耐受，延长同种移植物生存期提供了重要实验依据，展现了良好的应用前景，研究内容具有重要意义。<br>　　第一部分 同种排斥过程中IL-27Rα+细胞表达及对炎性细胞因子分泌的影响<br>　　研究方法:<br>　　1.同种及同系小鼠皮片移植模型的建立及移植物生存期观察<br>　　2.移植皮片H&E/免疫组化染色及Western Blot分析<br>　　3.移植皮片IL-27Rα/CD3/CD4/CD68免疫荧光染色<br>　　4.移植受体脾IL-27Rα与CD3/CD4阳性T细胞的流式细胞术分析<br>　　5.移植皮片IL-27与CD11c/CD3/CD68阳性细胞免疫荧光染色<br>　　6.IL-27Rα+细胞过继促进同种移植排斥的研究<br>　　7.同种移植排斥相关细胞因子表达的分析<br>　　研究结果:<br>　　1.同种移植后不同时间移植皮片IL-27Rα/IL-27表达状况:同种移植皮片在移植后第9天出现排斥，最晚排斥时间为第13天，中位生存期为11天。同系皮片未发生排斥。免疫组化染色及Western Blot均证实，移植后第10天同种排斥达到高峰期时，移植皮片IL-27Rα表达量最高，显著高于其他时间点及同时间点的同系移植皮片。此时同种移植皮片的IL-27表达最高。<br>　　2.CD3+/CD4+T细胞和CD68+巨噬细胞的IL-27Rα表达状况:CD3+/CD4+T细胞和CD68+巨噬细胞的细胞膜上均表达IL-27Rα。移植后第10天，同种移植组的脾IL-27Rα+CD3+T细胞比例及IL-27Rα+CD4+T细胞比例显著高于同系移植组。<br>　　3.CD3+T细胞/CD68+巨噬细胞和CD11c+细胞IL-27分泌状况:移植后第10天的移植物CD11c+细胞可检测到IL-27分泌，但CD3+T细胞及CD68+巨噬细胞未检测到IL-27分泌。<br>　　4.I L-27Rα阳性细胞单独过继可促进同种移植排斥反应:SCID同种移植模型中分别过继同种效应脾细胞及经流式细胞术中分选的纯IL-27Rα+细胞后，同种移植皮片均发生明显排斥，其中分选的IL-27Rα+细胞单独过继组的排斥时间明显早于混合脾细胞过继组，移植物生存期短。细胞过继后第14天，单独IL-27Rα+细胞过继组的移植皮片有大量炎性细胞浸润，免疫荧光染色证实主要是IL-27Rα+细胞。<br>　　5.IL-27Rα表达对IFN-γ/IL-10和IL-27表达的影响:同种移植排斥高峰期，移植物IL-27Rα+细胞的IFN-γ分泌显著增多，而IL-10分泌显著降低。与此一致的是模型鼠在同种排斥高峰期，血清IFN-γ、IL-27浓度明显增高，而IL-10浓度显著降低。<br>　　第二部分 IL-27Rα活化对同种移植排斥反应影响的分子机理<br>　　研究方法:<br>　　1.混合淋巴细胞培养<br>　　2.rIL-27对同种反应脾细胞增殖的影响<br>　　3.rIL-27对同种反应脾细胞凋亡的影响<br>　　4.rIL-27对细胞信号通路STAT1/STAT3/STAT5的影响<br>　　5.同种急性排斥期STAT1/STAT3/STAT5表达活化状况<br>　　研究结果:<br>　　1.rIL-27对同种反应脾细胞增殖的影响:随着rIL-27浓度增加，同种反应脾细胞增殖明显增强。25ng/ml rIL-27在24h即显示出明显促增殖作用，加入JAK/STAT抑制剂(Ruxolitinib/SH-4-54)及抗IL-27p28单抗后，rIL-27促增殖作用受到明显抑制。<br>　　2.rIL-27对同种反应脾细胞凋亡的影响:rIL-27抑制同种反应脾细胞凋亡，促进抗凋亡分子Pim2、Bcl-xL蛋白的表达。分别加入Ruxolitinib、SH-4-54及抗IL-27p28单抗抑制后，rIL-27抗凋亡效果明显降低。<br>　　3.rIL-27对同种反应脾细胞STAT1/STAT3/STAT5通路的影响:25ng/ml rIL-27作用24h可明显促进同种反应脾细胞中STAT1、STAT3和STAT5的磷酸化，并增强STAT1、STAT3和STAT5蛋白的表达。<br>　　4.同种急性排斥期STAT1/STAT3/STAT5的表达状况:同种移植急性排斥期移植物STAT1、STAT3和STAT5蛋白显著高表达。在IL-27Rα+细胞中检测到STAT1/STAT3/STAT5磷酸化蛋白表达。<br>　　第三部分 125I-anti-IL-27RαmAb制备及靶向监测同种移植排斥的研究<br>　　研究方法:<br>　　1.小鼠皮片移植模型的建立及IL-27Rα表达分析<br>　　2.放射性核素标记探针制备及鉴定<br>　　3.饱和实验及竞争结合分析<br>　　4.全身磷屏自显影显像<br>　　5.体内生物学分布研究<br>　　6.移植物125I-anti-IL-27RαmAb探针的摄取与IL-27Rα表达的相关性分析<br>　　研究结果:<br>　　1.同种移植急性排斥期移植物IL-27Rα的表达特点<br>　　2.125I-anti-IL-27RαnAb及125I-IgG制备及鉴定<br>　　3.125I-anti-IL-27RαmAb与细胞的饱和实验及竞争结合分析<br>　　4.全身磷屏自显影显像<br>　　5.标记探针生物学分布研究<br>　　6.移植物125I-anti-IL-27RαmAb的摄取与IL-27Rα表达的相关性分析<br>　　第四部分 IL-27Rα受体靶向的核素标记探针制备及在体监测同种排斥的研究<br>　　研究方法:<br>　　1.小鼠同种及同系皮片移植模型构建方法同第三部分。<br>　　2.放射性核素探针制备及鉴定<br>　　3.细胞饱和实验及竞争结合分析<br>　　4.全身磷屏自显影显像<br>　　5.体内生物学分布研究<br>　　6.标记探针血液清除率分析<br>　　7.移植物125I-rIL-27的摄取与IL-27Rα表达的相关性分析<br>　　研究结果:<br>　　1.125I-rIL-27鉴定<br>　　2.125I-rIL-27与同种效应脾细胞的饱和结合实验和竞争结合实验<br>　　3.全身磷屏自显影显像<br>　　4.生物学分布研究<br>　　5.标记探针血液清除率分析<br>　　6.移植物125I-rIL-27摄取与IL-27Rα表达的相关性分析<br>　　结论:<br>　　1.同种急性排斥反应中，移植物及脾高表达IL-27Rα，表达细胞主要是CD3+T细胞和CD68+巨噬细胞。IL-27Rα+细胞过继转输可导致并加速同种移植排斥反应。<br>　　2.CD3+IL-27Rα+细胞及CD68+IL-27Rα+细胞可促进IFN-γ分泌，降低IL-10分泌。CD11c+细胞可分泌IL-27。<br>　　3.激活IL-27Rα可通过STAT1/3/5细胞信号途径上调同种反应细胞增殖，增加抗凋亡分子表达，抑制同种反应细胞凋亡。<br>　　4.成功制备125I-anti-IL-27RαmAb，体外可与同种效应细胞IL-27Rα特异性结合，磷屏自显影显像显示标记探针在体内可特异性靶向同种移植物，可在早期提示同种急性排斥反应。<br>　　5.成功制备靶向IL-27Rα小分子受体显像分子探针125I-rIL-27，体外可与同种效应细胞IL-27Rα特异性结合，体内磷屏自显影显像可特异性显示同种移植物的急性排斥。具有血液清除快，显像本底低的特点。<br>　　创新点:<br>　　1.同种移植物急性排斥期IL-27Rα高表达，IL-27Rα阳性细胞过继转输可导致同种移植排斥。<br>　　2.IL-27Rα阳性细胞通过增强CD3+T细胞和CD68+巨噬细胞IL-27Rα表达，促进抗凋亡蛋白表达，促进细胞信号通路STAT1/3/5磷酸化，促进IFN-γ分泌和降低IL-10分泌，从而发挥促同种排斥作用。<br>　　3.成功制备两种靶向IL-27Rα的放射性核素标记探针，体外实验和体内小鼠同种移植模型在体磷屏自显影显像和生物学分布研究证实，两种探针均可特异性靶向同种移植物，移植物局部放射性浓聚与IL-27Rα表达高度正相关，提示IL-27Rα有望成为在体监测同种移植急性排斥的新的分子靶点。