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摘要血管生成素样蛋白4(Angiopoietin-1ike4，ANGPTL4)是一种分泌型代谢调节糖蛋白，与糖脂代谢、肿瘤和炎症性疾病有关。巨噬细胞和CD8+T细胞参与多种疾病的发生发展，它们的能量代谢方式与其分化及功能状态密切相关。然而，ANGPTL4可否通过调控能量代谢而直接影响免疫细胞的活性，继而参与炎症或肿瘤的发生，目前尚不清楚。<br>　　落新妇苷作为土茯苓等中药中的主要成分，是一种黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎和免疫抑制作用。课题组前期研究结果证实落新妇苷处理免疫细胞后，NF-κ3和p38MAPK表达降低，SOCS3和AMPK表达增加。然而落新妇苷对接哪些分子以启动级联信号，调节CD4+T功能变化，期待进一步研究。<br>　　本研究旨在阐明ANGPTL4基于糖脂代谢调控巨噬细胞和CD8+T细胞生物学功能的分子机制，以及明确落新妇苷对效应性CD4+T细胞的调节作用和潜在结合靶点。<br>　　研究内容分为三部分:<br>　　第—部分:ANGPTL4缺陷诱导巨噬细胞脂肪酸代谢失调从而增强其功能<br>　　目的:基于ANGPTL4的代谢作用，本研究深入探讨内源性ANGPTL4在巨噬细胞中调节自身代谢的作用，以及阐明巨噬细胞内缺乏ANGPTL4引起代谢方式的改变对巨噬细胞功能的影响。<br>　　方法:流式检测ANGPTL4缺乏后巨噬细胞的频率;体外给予重组ANGPTL4蛋白，观察巨噬细胞的功能变化:WesternBlot和细胞能量代谢检测仪评估巨噬细胞的代谢方式，并分析其潜在的分子机制。<br>　　结果:在本研究中，我们发现与WT小鼠相比，ANGPTL4-/-小鼠脾脏中巨噬细胞频率增加，TNF-α、CD86和iNOS表达增高。然而，体外使用重组ANGPTL4蛋白却不能抑制巨噬细胞的功能。进一步检测发现ANGPTL4-/-小鼠巨噬细胞的糖酵解和脂肪酸合成增加，巨噬细胞胞浆内游离脂肪酸水平升高，而脂肪酸氧化分解代谢降低。LPS刺激ANGPTL4-/-小鼠巨噬细胞后胞内出现内质网应激，同时蛋白激酶B(proteinkinaseB，Akt)、哺乳动物的雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin，mTOR)信号通路被激活，但肝激酶B1(liverkinaseB1，LKB1)和单磷酸腺苷(AMP)激活的蛋白激酶(5''-AMPactivatedproteinkinase，AMPK)磷酸化无明显变化。通过调节脂肪酸代谢可以抑制巨噬细胞内质网应激和炎症分子的表达，但抑制糖酵解却不能下调ANGPTL4-/-小鼠巨噬细胞的活性。<br>　　结论:综上所述，巨噬细胞中ANGPTL4缺失可以诱导胞内脂肪酸代谢重编程从而引起内质网应激和炎症反应。因此，通过调控细胞内ANGPTL4的表达可以调节巨噬细胞的功能。<br>　　第二部分:ANGPTL4通过代谢重编程增强CD8+T细胞的活性从而延缓肿瘤进展<br>　　目的:研究ANGPTL4如何调控CD8+T细胞在肿瘤微环境中的活性，从而影响肿瘤的发生与发展，并阐明其潜在的分子机制。<br>　　方法:流式检测ANGPTL4-/-小鼠CD8+T细胞的频率及效应功能;制备小鼠肿瘤模型，评估ANGPTL4缺陷后CD8+T细胞的抗肿瘤活性;WesternBlot和细胞能量代谢检测仪评估CD8+T细胞的代谢方式及其分子机制;收集临床标本，探讨ANGPTL4对结直肠癌中CD8+T细胞的临床影响。<br>　　结果:在本研究中，我们发现与WT小鼠相比，ANGPTL4-/-小鼠中效应性CD8+T细胞增多。皮下移植3LL、B16BL6或MC38细胞后，ANGPTL4乒小鼠皮下移植瘤生长缓慢。尾静脉注射B16F10细胞后肺转移减少。进一步通过骨髓移植实验证明，无论是宿主细胞还是骨髓细胞，ANGPTL4的缺失都可促进CD8+T细胞活化，且CD8+T细胞本身缺乏ANGPTL4表现出更有效的抗肿瘤活性。在WT小鼠体内注射重组ANGPTIM蛋白后，小鼠移植瘤生长增快，且肿瘤组织中CD8+T细胞浸润减少。体外使用重组ANGPTL4蛋白刺激CD8+T细胞后，CD8+T细胞活性降低。通过转录组学和细胞能量代谢检测仪分析发现，ANGPTL4缺陷通过PKC-LKB1-AMPK-mTOR信号轴增加CD8+T细胞糖酵解，减少其脂肪酸氧化磷酸化。结直肠癌患者的血清和肿瘤组织中ANGPTL4水平升高，与外周血中CD8+T细胞活化呈负相关。<br>　　结论:综上所述，ANGPTL4通过对CD8+T细胞的免疫调节，降低其在肿瘤进展过程中的免疫监视作用。有效阻断肿瘤患者ANGPTL4的表达可促进CD8+T细胞抗肿瘤活性。<br>　　第三部分:落新妇苷结合CYPlBl激活ROS/PPAR7通路抑制效应性CD4+T细胞活性<br>　　目的:在本研究中，我们明确落新妇苷对效应性CD4+T细胞功能的影响，分析落新妇苷的潜在靶点以及相关分子机制。<br>　　方法:流式检测不同剂量落新妇苷对CD4+T细胞活性的影响;体内给予落新妇苷，观察其对NOD小鼠l型糖尿病发病进展的影响;通过转录组学和WesternBlot研究落新妇苷抑制CD4+T细胞活性的分子机制;采用生物信息学分析和表面等离子体共振法检测落新妇苷的对接分子。<br>　　结果:本研究中，我们发现落新妇苷能有效抑制体外CD4+T细胞TNF-α的产生，轻微抑制IFN-γ的分泌，并增加CCR9和CD36的表达。体内给予落新妇苷可以明显减缓NOD小鼠l型糖尿病的发生。此外，PPARγ/SCOS3、PPARγ/PTEN和PPARy/ANGPTL4/AMPK信号通路被大量激活，并在落新妇苷诱导CD4+T细胞功能下调中发挥关键作用。通过转录组学结果证实，落新妇苷参与调控免疫系统或炎症反应的相关信号分子，发挥类似氧化或抗氧化酶活性的功能。落新妇苷可以直接诱导CD4+T细胞胞质内ROS产生，但对线粒体ROS和线粒体质量无影响。当使用NAC减少CD4+T细胞内ROS产生后，NAC显著逆转落新妇苷处理的CD4+T细胞中TNF-α、IFN-γ、CCR9、CD36和相关信号分子(PPAR7、PTEN、AMPK和SCOS3)的表达。基于生物信息学分析，筛选出2种细胞色素P450酶(CYP1B1和CYP19A1)作为落新妇苷的候选靶点。最后，通过AutoDockVina软件分析和表面等离子体共振分析，确定CYP1B1为落新妇苷(KD=18.2μM)刺激CD4+T细胞在ROS产生的对接蛋白。<br>　　结论:综上所述，落新妇苷通过CYP1B1/ROS/PPARγ通路下调效应性CD4+T细胞活性，从而减缓1型糖尿病的发生发展，证明了落新妇苷在炎症治疗中的潜在应用。