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摘要胃癌(Gastric cancer，GC)是全球最常见的恶性肿瘤之一，国际最新的统计资料显示，胃癌的发病率位列全球恶性肿瘤发病率第五，相关死亡率位列第四，其中，男性的发病率是女性的2倍，东亚和东欧的发病率最高。国内最新的流行病学资料显示，在2000～2019年期间，我国的胃癌发病率和死亡率总体呈下降趋势，但60～69岁的男性人群是胃癌发病的高危人群。国家肿瘤中心预测2022年我国将有50.9万人确诊胃癌，相关死亡人数预估有40万，发病率和死亡率在常见癌症中均排第三位。近几十年来，尽管胃癌的综合治疗策略在不断发展，新药在不断研发利用，但由于胃癌具有较强的异质性且早期诊断率低的特点，胃癌的预后依然较差。<br>　　P2RX7是一种跨膜受体，其编码基因位于12号染色体上，编码13个外显子，转化为含有595个氨基酸的蛋白质，是P2X家族中最大的蛋白质。<br>　　本论文分为临床研究和基础研究两部分，第一部分旨在通过免疫组化和中医辨证研究胃癌P2RX7的表达状态与中医脾虚毒蕴证的相关性。第二部分首先阐释与证明P2RX7在胃癌细胞AGS中的作用，然后进一步探讨运化毒邪方健脾化毒治疗胃癌可能的分子机制。<br>　　第一部分 胃癌P2RX7表达状态与中医脾虚毒蕴证的相关性研究<br>　　目的:通过免疫组化检测P2RX7在胃癌组织中的表达差异，分析P2RX7的表达水平与胃癌脾虚毒蕴证的相关性，并探讨胃癌脾虚毒蕴证的危险因素。<br>　　方法:收集胃癌新发病例，收集患者的中医四诊资料，填写中医症状调查表，并进行辨证分型，收集患者的手术或胃镜石蜡切片进行免疫组织化学检测，结果采用x2检验、Pearson相关性分析和Logistic回归分析方法研究P2RX7表达与胃癌脾虚毒蕴证的关系。<br>　　结果:本研究共纳入胃癌病例80个。其中，男性42例，女性38例;有肿瘤家族史者为21例;P2RX7高表达者47例，低表达者33例;TNM分期为Ⅰ期4例，Ⅱ期19例，Ⅲ期44例，Ⅳ期13例;中医辨证为脾虚毒蕴证者36例，非脾虚毒蕴证者44例(其中，肝胃不和者13例;脾胃虚寒者11例;胃热伤阴者11例;气血亏虚者9例)。x2检验显示胃癌脾虚毒蕴证患者的P2RX7蛋白表达水平显著高于胃癌非脾虚毒蕴证患者(*P＜0.05)，Pearson相关性分析结果显示P2RX7与脾虚毒蕴证具有一定的相关性(R2=0.253，**P＜0.01)，多因素Logistic回归分析显示P2RX7蛋白高表达(P=0.006)和肿瘤家族史(P=0.018)是胃癌患者脾虚毒蕴证的独立危险因素。<br>　　结论:胃癌脾虚毒蕴证患者的肿瘤组织中P2RX7显著高表达，胃癌患者肿瘤组织中P2RX7表达状态与脾虚毒蕴证相关，且P2RX7高表达是胃癌患者脾虚毒蕴证的独立危险因素。<br>　　第二部分 基础实验<br>　　一、Western blot检测P2RX7在人胃癌组织及细胞系中的表达<br>　　目的:验证人胃癌组织和正常胃粘膜组织、人胃癌细胞系和正常人胃粘膜细胞中P2RX7蛋白的表达差异。<br>　　方法:通过Western Blot法分别检测5对新鲜的人胃癌组织和正常胃粘膜组织，胃癌AGS、HGC-27细胞系和正常人胃粘膜细胞GES-1中P2RX7蛋白的表达水平。<br>　　结果:与配对的正常胃粘膜组织相比，P2RX7蛋白在胃癌组织中的表达水平相对升高，差异具有统计学意义(*P＜0.05***P＜0.001);与人胃粘膜上皮细胞GSE-1相比，P2RX7蛋白在胃癌AGS和HGC-27细胞系中的表达水平均相对升高，差异具有统计学意义(***P＜0.001)。<br>　　结论:P2RX7在人胃癌组织和人胃癌细胞系AGS和HGC-27中均高表达。<br>　　二、构建稳定的P2RX7高表达、P2RX7低表达及各自对照组的人胃癌细胞AGS<br>　　目的:构建稳定高表达和低表达P2RX7的人胃癌AGS细胞株<br>　　方法:取对数期生长的AGS细胞接种至6孔板中，用Lv-P2RX7、Lv-P2RX7-ctrl、Lv-P2RX7-RNAi、Lv-P2RX7-RNAi-ctrl慢病毒存储液感染AGS。感染约16h后更换为完全培养基继续培养1-2天，保持细胞活性。感染后约72h，更换为含有嘌呤霉素(puromycin)的完全培养基，设置嘌呤霉素的浓度为4μg/ml，继续培养持续筛选细胞，直至获得构建成功的AGS/Lv-P2RX7、AGS/Lv-P2RX7-ctrl、AGS/Lv-P2RX7-RNAi、AGS/Lv-P2RX7-RNAi-ctrl细胞株，并用WesternBlot法检测验证。<br>　　结果:倒置荧光显微镜下观察，大部分细胞贴壁良好，细胞边界光滑，核质均匀清晰，绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)表达较强，感染效率较高，约90％。Western Blot结果显示与相应的空载体组对比，AGS/Lv-P2RX7细胞中的P2RX7蛋白表达增高(***P＜0.001)，AGS/Lv-P2RX7-RNAi细胞中的P2RX7蛋白表达降低(***P＜0.001)。<br>　　结论:AGS/Lv-P2RX7、AGS/Lv-P2RX7-ctrl、AGS/Lv-P2RX7-RNAi、AGS/Lv-P2RX7-RNAi-ctrl细胞株构建成功。<br>　　三、P2RX7的激活能够促进人胃癌细胞AGS的迁移和侵袭<br>　　目的:证实P2RX7能够促进人胃癌细胞的迁移和侵袭。<br>　　方法:采用CCK-8、细胞划痕、Transwell实验证实P2RX7在人胃癌细胞AGS的生存活力、迁移和侵袭中的作用。Western Blot实验研究P2RX7对PI3K/AKT/GSK-3β信号网络以及EMT相关蛋白的调控作用。<br>　　结果:CCK-8、细胞划痕、Transwdl实验结果显示P2RX7过表达能够增强人胃癌细胞AGS的活力，促进迁移和侵袭;P2RX7低表达则相反(*P＜0.05，***P＜0.001)。Western Blot实验结果显示，相比于空载体组(人胃癌AGS/Lv-P2R X7-ctrl细胞)，P2RX7过表达时，p-PI3K、p-Akt、P-GSK-3β、β-catenin、VEGF-C蛋白以及EMT相关蛋白N-cadherin、Vimentird表达水平升高，E-cadherin表达水平降低(***P＜0.001);反之，相比于空载体组(AGS/Lv-P2RX7-RNAi-ctrl细胞)，P2RX7低表达时，p-PI3K、p-Akt、p-GSK-3β、β-catenin、VEGF-C蛋白以及EMT相关蛋白N-cadherin、Vimentin表达水平降低，E-cadherin表达水平升高(***P＜0.001)。<br>　　结论:P2RX7可调控P13K/AKT/GSK-3β信号网络，并诱导EMT，促进人胃癌细胞AGS迁移和侵袭。<br>　　四、运化毒邪方调控P2RX7抑制人胃癌细胞AGS的增殖、侵袭与转移的作用研究<br>　　目的:探究运化毒邪方能否通过调控P2RX7抑制人胃癌细胞AGS的增殖、侵袭与转移。<br>　　方法:制备含生药2g/mL的浸膏，经滤膜过滤除菌后备用。体外培养AGS/Lv-P2RX7、AGS/Lv-P2RX7-RNAi、野生AGS细胞至对数生长期，设置运化毒邪方浓度为1、2、4、8、16、32mg/ml。通过MTT法检测运化毒邪方对人AGS/Lv-P2RX7、AGS/Lv-P2RX7-RNAi、野生AGS细胞增殖的影响，并计算半数抑制浓度(IC50)。后续实验将药物浓度设定为低浓度6mg/ml，高浓度12mg/ml，并通过划痕实验、Transwell实验分别观察运化毒邪方对AGS/Lv-P2RX7、AGS/Lv-P2RX7-RNAi、野生AGS细胞迁移和侵袭能力的影响;Western Blot实验检测运化毒邪方对P2RX7/PI3K/AKT/GSK-3β信号网络以及EMT的调控作用。<br>　　结果:MTT结果显示运化毒邪方处理24h后，AGS、AGS/Lv-P2RX7、AGS/Lv-P2RX7-RNAi细胞的增殖明显受到了抑制，且呈浓度依赖性(***P＜0.001)。运化毒邪方对上述三种细胞株的半数抑制浓度(IC50)分别约为11.680mg/ml、12.420mg/ml、11.464mg/ml。运化毒邪方6mg/ml、12mg/ml干预胃癌AGS、AGS/Lv-P2RX7、AGS/Lv-P2RX7一RNAi细胞24h后，与各自的不加药组(阴性对照组)相比，细胞划痕和Transwell结果显示:AGS、AGS/Lv-P2RX7、AGS/Lv-P2RX7-RNAi细胞的伤口愈合和迁移侵袭能力明显受到了抑制，且呈浓度依赖性(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)。Western Blot结果显示，运化毒邪方6mg/ml、12mg/ml干预24h后，上述三株细胞中的P2RX7蛋白表达水平明显降低，且下调p-PI3K、p-Akt、p-GSK-3β、β-catenin、VEGF-C蛋白的表达，N-cadherin、Vimentin表达水平降低，E-cadherin表达水平升高(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)。<br>　　结论:运化毒邪方能通过调控P2RX7抑制人胃癌细胞AGS的增殖、侵袭与转移。