缩宫素对上皮源性细胞因子表达的调节及其缓解食物过敏的机制研究-论文-万方医学网

缩宫素对上皮源性细胞因子表达的调节及其缓解食物过敏的机制研究

二维码有效期 120s

收藏纠错

摘要研究背景 　　流行病学调查显示，近二三十年，全球食物过敏(Foodallergy，FA)的发病率不断上升，尤其是在工业化发达的国家地区，逐渐成为一种影响儿童和成人的重要公共卫生问题。理论上，任何食物均可成为潜在过敏原，引起的过敏症状从轻微到严重不等，可影响多种器官和系统，以胃肠道为主，也包括皮肤、心血管、呼吸系统，甚至全身。食物过敏是一种对特定食物产生的不良反应，针对其发病机制的研究对临床安全有效的治疗具有重要意义。食物过敏可分为免疫球蛋白E(ImmunoglobulinE，IgE)介导、非IgE介导以及IgE和非IgE共同介导三种类型。其中，IgE介导的食物过敏最为常见，其病理特征包括食物抗原特异性IgE的形成、2型辅助性T细胞(Thelper2cell，Th2)极化并过度产生Th2型细胞因子、肥大细胞等效应细胞激活并释放过敏介质。然而，为什么某类人群容易发生对食物抗原的过敏，其机制目前尚不明确。 　　近期大量证据表明，易感体质的形成与屏障上皮功能紊乱密切相关。屏障上皮细胞通过模式识别受体识别病原体相关分子模式(Pathogen-associatedmolecularpattern，PAMP)，生成上皮源性细胞因子(Epithelialcell-derivedcytokines，ECDCs)来响应环境中的危险信号。肠上皮细胞不仅组成抵御食物抗原的第一道屏障，而且通过生成胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymicstromallymphopoietin，TSLP)、白介素-25(Interleukin-25，IL-25)、白介素-33(Interleukin-33，IL-33)等ECDCs，启动、调控和加重过敏反应，是食物过敏的中枢调节器。ECDCs可作用于包括树突状细胞、T细胞、2型固有淋巴样细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞等在内的多种固有和适应性免疫细胞群，是至关重要的“促过敏因子”，控制着下游过敏反应的命运。ECDCs的异常产生是食物过敏发病过程中最为重要的启动因子和放大因子，因此，ECDCs正成为预防和治疗食物过敏新的靶点。然而，目前的研究多集中于ECDCs对下游过敏反应的调控，对ECDCs本身的产生及调控机制研究较少。 　　缩宫素(Oxytocin，OT)是第一个被化学性描述并人工合成的肽类激素，主要由下丘脑室旁核和视上核的神经元产生，可经神经投射直接释放入中枢或经垂体后叶释放进入外周循环，其经典功能是在分娩时引起子宫收缩以及在哺乳时促进乳汁排出。随着研究的深入，OT被发现具有远超其经典作用的多效功能，包括调节母性行为及社会行为、影响自主神经系统和免疫系统等。目前，使用OT或其类似物己被确定为一种临床干预手段，在治疗自闭症和精神分裂症的临床试验中取得重大研究进展。近期，有学者提出OT可作为一种免疫调节剂，发挥抑制炎症和抗氧化作用，具有一定的临床治疗潜力。然而，目前OT相关研究多集中于感染性疾病模型和与免疫紊乱相关的精神障碍疾病模型中，OT在自身免疫性疾病、超敏反应、移植排斥反应中的作用研究较少。我们课题组以及其他实验室的研究均己证实，OT可由肠神经系统分泌，肠道上皮表达缩宫素受体(Oxytocinreceptor，OTR)。在实验性结肠炎中，我们发现OT可以调节消化道巨噬细胞和肥大细胞的功能。但OT/OTR信号系统在食物过敏中的作用，特别是对肠上皮在过敏时分泌ECDCs的作用及其机制目前尚不明确。 　　本研究通过临床样本、动物模型和细胞实验，系统性探究OT在食物过敏中的作用及其调节肠上皮细胞表达ECDCs的机制，为食物过敏的治疗提供新的思路及理论基础。 　　第一部分缩宫素对食物过敏的调节作用 　　研究目的 　　既往研究表明，OT具有抗炎作用，但其对食物过敏的影响尚不明确。本研究通过临床样本和动物模型，探究OT系统是否参与食物过敏的调节，以及对分泌ECDCs的影响。 　　研究方法 　　1.临床病例收集。以13例食物过敏儿童患者及12例同年龄对照样本、12例食物过敏成人患者及11例同年龄对照样本作为研究对象，收集各组血浆用于后续检测。 　　2.构建食物过敏动物模型。以BALB/c为研究对象，于第O、14天两次腹腔注射卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)和硫酸铝钾佐剂混合物致敏小鼠。第28天开始，配制OVA灌胃溶液，每隔一天灌胃一次。期间记录小鼠腹泻发生率、粪便性状评分、过敏评分等疾病评价指标，并在最后一次灌胃后处死各组小鼠，取血和肠道组织备用。 　　3.构建OT治疗的食物过敏动物模型。以OVA诱导的方式构建食物过敏模型，从第0天开始，每只小鼠腹腔注射OT1mg/kg，每天一次。观察并记录小鼠腹泻发生率、粪便性状、过敏症状和体征，使用腹泻评分量表和过敏评分量表对各组小鼠发生食物过敏的严重程度进行评估，并在最后一次灌胃后处死各组小鼠，取血和肠道组织备用。 　　4.应用苏木素-伊红染色，观察小鼠空肠绒毛形态、炎症细胞浸润程度等病理改变。 　　5.应用甲苯胺蓝染色，观察小鼠空肠组织肥大细胞数目、形态、脱颗粒程度。 　　6.采用ELISA方法检测人体和小鼠样本中的目标蛋白，包括人血浆OT含量;小鼠血清和空肠组织匀浆中OT含量;小鼠血清抗体水平以及肥大细胞特异性蛋白酶-1(Mousemastcellprotease-1，mMCP-1)释放量;小鼠空肠组织匀浆中Th2型细胞因子水平和组胺释放量;小鼠空肠黏膜层ECDCs水平。 　　7.采用Westernblot方法检测小鼠空肠黏膜层OTR表达量。 　　研究结果 　　1.食物过敏患者血浆OT浓度异常升高 　　为探究OT是否参与食物过敏的调节，本实验按照年龄分组收集食物过敏病例样本及其同年龄对照样本，检测其血浆OT浓度。结果显示，与对照组相比，食物过敏儿童患者和成人患者的血浆中OT浓度均明显升高，提示OT与食物过敏相关。 　　2.OVA诱导的食物过敏小鼠体内OT和OTR表达异常升高 　　构建OVA诱导的食物过敏动物模型，收集OVA过敏小鼠及其对照组的血清及肠道组织，检测血清和空肠组织匀浆中OT含量，结果显示，与对照组相比，OVA过敏小鼠的血清和空肠组织匀浆中OT含量均明显增加，空肠黏膜层表达OTR明显升高。以上结果说明OVA过敏时OT和OTR表达上调，进一步提示OT信号系统与食物过敏相关。 　　3.注射OT缓解OVA模型小鼠发生的食物过敏 　　为探究OT在食物过敏中的作用，本实验给予1mg/kgOT处理OVA过敏小鼠。结果显示，OT处理可显著降低小鼠由OVA诱导的腹泻发生率，使小鼠粪便性状保持基本正常，过敏症状和体征明显减轻。取空肠组织进行组织学评估，OT处理组小鼠的肠黏膜损伤明显减轻，炎症细胞浸润减少。以上结果说明OT处理可改善OVA诱导的食物过敏症状。 　　4.注射OT减轻OVA模型小鼠的过敏反应 　　为评估过敏反应严重程度，检测各组小鼠体内抗体水平、Th2型细胞因子水平和肥大细胞状态。结果显示，OT处理组小鼠血清IgE和OVA-IgE水平明显降低;空肠组织匀浆中包括IL-4、IL-5、IL-9、IL-13在内的Th2型细胞因子明显下降;血清mMCP-1和空肠组胺含量显著降低，空肠肥大细胞数量减少。以上结果说明OT处理减轻了OVA诱导的过敏反应。 　　5.注射OT抑制OVA模型小鼠肠上皮产生ECDCs 　　既往研究表明，ECDCs是启动和加重过敏反应的关键上游介质。本实验对各组小鼠空肠黏膜层分离、收集并检测其ECDCs表达水平。结果显示，OVA过敏小鼠分泌TSLP、IL-25、IL-33明显升高，OT处理可显著抑制这些ECDCs的升高。因此推测，OT对过敏反应的抑制作用可能是通过抑制肠上皮生成ECDCs引起的。我们将在第二部分进一步探究其机制。 　　第二部分缩宫素对上皮源性细胞因子表达的调节作用及其机制研究 　　研究目的 　　OT可以抑制ECDCs分泌，但其机制尚不明确。本研究通过细胞实验和动物模型，探究OT调节肠上皮细胞表达ECDCs的具体机制，为食物过敏的治疗提供新的潜在靶点。 　　研究方法 　　1.传代方法培养人类肠上皮细胞系HT-29。 　　2.采用小干扰RNA技术下调HT-29细胞的OTR表达或β-arrestin2表达。 　　3.构建食物过敏动物模型同第一部分。 　　4.采用ELISA方法检测HT-29细胞裂解液中TSLP、IL-25、IL-33表达水平。 　　5.采用Westernblot检测HT-29细胞裂解液和小鼠空肠黏膜匀浆中NF-κB磷酸化水平、IκB-α蛋白水平和β-arrestin2蛋白水平。 　　研究结果 　　1.LPS刺激HT-29细胞分泌ECDCs 　　为进一步研究OT对肠上皮分泌ECDCs的影响，我们选择人类肠上皮细胞系HT-29进行体外实验。已有研究证明OVA中含有少量LPS，LPS是激活屏障上皮细胞生成ECDCs的常见因素，因此我们应用0.2、2、20mg/mlOVA和10、100、1000ng/mlLPS刺激HT-29细胞，检测细胞裂解液中ECDCs含量。结果显示，2、20mg/mlOVA和100、1000ng/mlLPS均可促进HT-29细胞生成TSLP、IL-25和IL-33。因此，我们选用100ng/mlLPS进行后续实验，以模拟OVA刺激肠上皮产生ECDCs。 　　2.OT抑制HT-29细胞表达ECDCs 　　首先确认HT-29细胞是否表达OTR，通过Westernblot检测我们发现，HT-29细胞组成性表达OTR。然后，我们检测10-6、10-7、10-8、10-9MOT孵育后细胞裂解液中ECDCs的含量变化，结果显示，用10-7M和10-8MOT孵育HT-29细胞后，LPS刺激产生的TSLP、IL-25和IL-33水平均明显降低。为明确OT的作用受体，利用siRNA下调HT-29细胞表达OTR并检测其转染效率，然后，用OTRsiRNA及其对照ScrsiRNA对HT-29细胞进行转染，检测细胞裂解液中ECDCs含量，结果显示，OTRsiRNA转染后10-8MOT孵育不再抑制LPS刺激产生的TSLP、IL-25、IL-33。以上结果说明，OT依赖其受体OTR发挥对ECDCs表达的抑制作用。 　　3.OT通过β-arrestin2途径抑制HT-29细胞表达ECDCs 　　OTR是一种G蛋白偶联受体(G-protein-coupledreceptor，GPCR)，有研究表明β-arrestin2可介导GPCRs激活的细胞内信号。本实验发现LPS刺激HT-29细胞内β-arrestin2蛋白表达下调;10-8MOT孵育后，显著缓解LPS对β-arrestin2蛋白的下调作用。当使用OTRsiRNA转染HT-29细胞后，10-8MOT孵育对β-arrestin2的上调作用消失。为进一步明确β-arrestin2在OT/OTR信号调控ECDCs表达方面的作用，利用siRNA下调HT-29细胞β-arrestin2表达并检测其转染效率。然后，用βarr2siRNA及其对照ScrsiRNA对HT-29细胞进行转染，检测细胞裂解液中ECDCs含量，结果显示，当使用βarr2siRNA转染HT-29细胞后，10-8MOT孵育不再对LPS刺激产生的TSLP、IL-25、IL-33有抑制作用。以上结果说明，β-arrestin2是OT/OTR信号调控HT-29细胞经LPS刺激表达ECDCs的重要中介蛋白。 　　4.OT通过抑制NF-κB通路抑制HT-29细胞表达ECDCs 　　既往研究表明，ECDCs表达可能受NF-κB信号通路调控。本实验发现LPS引起HT-29细胞内NF-κB磷酸化水平明显上升，IκB-α大量降解;Bayll-7082阻断NF-κB通路后，TSLP、IL-25和IL-33的表达均不再受LPS影响，说明LPS通过NF-κB通路促进ECDCs分泌。我们用10-8MOT孵育细胞，发现其能够明显抑制LPS激活的NF-κB磷酸化和IκB-α降解。当用OTRsiRNA转染HT-29细胞后，10-8MOT孵育的上述抑制作用消失。而用βarr2siRNA转染HT-29细胞后，10-8MOT抑制NF-κB磷酸化的作用也被逆转。以上结果说明，OT/OTR信号可通过上调β-arrestin2抑制被LPS激活的NF-κB信号通路，从而抑制ECDCs表达。 　　5.注射OT抑制OVA模型小鼠肠上皮内NF-κB磷酸化，并上调β-arrestin2表达 　　我们进一步在动物模型中对上述信号通路进行验证。分离并检测各组小鼠空肠黏膜组织NF-κB通路相关蛋白和β-arrestin2蛋白水平，结果显示，OVA过敏小鼠NF-κB磷酸化水平增高，IκB-α降解增加，β-arrestin2表达下降;注射OT可明显抑制上述变化，与在HT-29细胞中的结果一致。 　　第三部分内源性缩宫素信号系统在食物过敏中的作用及其机制 　　研究目的 　　我们的前期研究证明了OT可以缓解食物过敏;OT通过OTR-β-arrestin2-NF-κB通路抑制ECDCs表达。本研究通过敲基因动物模型，探究内源性OT/OTR信号通路在食物过敏中的作用及其机制，为食物过敏的治疗提供新的思路及理论基础。 　　研究方法 　　1.建立OTR敲除鼠。以ubc-Cre小鼠和OTRfl/fl小鼠进行杂交，最终获得OTR-/-小鼠，以同窝OTRfl/fl小鼠作为对照。 　　2.构建OVA诱导的OTR-/-小鼠食物过敏模型，方法同第一部分。 　　3.苏木素-伊红染色和甲苯胺蓝染色，取OTR-/-小鼠及OTRfl/fl小鼠空肠组织石蜡包埋切片后，观察空肠绒毛形态、炎症细胞浸润程度、肥大细胞数目、形态以及脱颗粒程度等病理改变。 　　4.采用ELISA方法检测OTR-/-小鼠及OTRfl/fl小鼠血清抗体水平和mMCP-1;空肠组织匀浆中组胺释放量和Th2型细胞因子水平;空肠黏膜层ECDCs水平。 　　5.采用Westernblot方法检测OTR-/-小鼠及OTRfl/fl小鼠空肠黏膜层NF-κB磷酸化水平、IκB-α蛋白水平和β-arrestin2蛋白水平。 　　研究结果 　　1.OTR-/-小鼠在OVA诱导条件下发生食物过敏 　　为探究内源性OT在食物过敏发病过程中的作用，本实验培育OTR-/-小鼠，并构建OVA诱导的食物过敏模型。结果显示，与OTRfl/fl小鼠相比，OVA诱导OTR-/-小鼠发生过敏性腹泻的概率显著上升;粪便性状明显改变，水样便增多;过敏症状、体征加重。取空肠组织进行组织学评估，发现与OTRfl/fl小鼠相比，OVA诱导OTR-/-小鼠肠道组织损伤加重，炎症细胞浸润增多。以上结果提示内源性OT对食物过敏具有一定保护作用。 　　2.经OVA诱导的OTR-/-小鼠表现出活跃的过敏反应 　　为评估过敏反应严重程度，检测小鼠体内抗体水平、Th2型细胞因子水平和肥大细胞状态。结果显示，与OTRfl/fl小鼠相比，OVA诱导的OTR-/-小鼠血清IgE和OVA-IgE水平升高;空肠组织中IL-4、IL-5、IL-9和IL-13含量明显升高，Th2型细胞因子在肠道局部大量产生;肥大细胞数目增多，血清mMCP-1和空肠组胺释放量增加。以上结果提示内源性OT/OTR信号系统可抑制OVA引起的过敏反应。 　　3.经OVA诱导的OTR-/-小鼠分泌ECDCs异常增多 　　为进一步探究OT/OTR信号系统在食物过敏中的作用，本实验分离、收集各组小鼠空肠黏膜层并检测ECDCs表达水平，结果显示，与OTRfl/fl小鼠相比，OTR-/-小鼠产生TSLP、IL-25、IL-33明显增多。以上结果提示内源性OT/OTR信号系统可以抑制肠上皮生成ECDCs。 　　4.经OVA诱导的OTR-/-小鼠NF-κB通路异常激活，β-arrestin2表达下调 　　为进一步探究OT/OTR信号系统的体内作用机制，本实验剥离空肠黏膜层并检测NF-κB通路相关蛋白和β-arrestin2蛋白水平，结果显示，与OTRfl/fl小鼠相比，OVA诱导的OTR-/-小鼠IκB-α降解明显，NF-κB磷酸化水平上升，β-arrestin2蛋白表达下调。以上结果提示OT/OTR信号具有抑制肠上皮NF-κB信号通路和上调β-arrestin2表达的作用。 　　研究结论 　　1.OT/OTR信号系统具有抗过敏作用。在食物过敏动物模型中，注射OT可以显著缓解过敏反应，减轻肠道炎症，减少ECDCs分泌;OTR敲除鼠发生严重的过敏反应，肠道炎症加剧，ECDCs分泌增多，提示内源性和外源性OT均具有抗过敏作用。 　　2.OT/OTR信号抑制ECDCs表达。在体和离体实验均证明，OT通过其受体OTR，上调β-arrestin2表达，抑制NF-κB信号通路，从而抑制肠上皮细胞产生TSLP、IL-25、IL-33。 　　3.食物过敏患者血浆OT含量升高，食物过敏模型小鼠体内OT和OTR表达上调，提示OT可以作为食物过敏发生的标志物之一。