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摘要本文从以下几个方面进行论述：<br>　　第一部分 血小板生成素受体激动剂调控ITP患者MDSCs免疫功能的机制探究<br>　　目的:<br>　　1.探究TPO-RA对MDSCs免疫功能的调控作用。<br>　　2.探究TPO-RA调控MDSCs免疫功能的机制。<br>　　方法:<br>　　1.ITP患者及健康对照标本收集:收集ITP患者TPO-RA治疗前后的外周血标本，流式细胞术检测MDSCs比例变化;收集活动期ITP患者及健康对照的外周血标本，用于体外细胞实验。<br>　　2.被动型ITP小鼠模型构建及指标检测:通过输注anti-CD41抗体构建被动型ITP小鼠模型，设置对照组、TGF-β1受体抑制剂(TGF-β1)组、TPO-RA组、TPO-RA+TGF-β1组进行药物干预。监测各组小鼠血小板数量变化;流式细胞术检测各组小鼠骨髓MDSCs比例;评估血小板数量与MDSCs比例的相关性。<br>　　3.主动型ITP小鼠模型构建及指标检测:用野生型C57BL/6J小鼠的血小板对同源CD61基因敲除(knock out，KO)小鼠进行免疫，再将免疫成功的CD61KO小鼠脾脏细胞转输给辐照处理后的联合免疫缺陷(severe combined immunodeficient，SCID)小鼠，从而构建主动型ITP小鼠模型。设置对照组、TGF-β1组、TPO-RA组、TPO-RA+TGF-β1组进行药物干预。监测各组小鼠血小板数量变化;流式细胞术检测各组小鼠骨髓MDSCs比例及功能分子表达水平;ELISA检测各组小鼠血清TGF-β1表达水平;进一步评估血小板数量与MDSCs比例、血小板数量与血清TGF-β1水平以及血清TGF-β1水平与MDSCs比例的相关性。<br>　　4.MDSCs细胞治疗模型构建及指标检测:免疫磁珠分选各组主动型ITP小鼠的骨髓MDSCs，转输给新构建的主动型ITP小鼠，构建为MDSCs细胞治疗模型，体内探究各组MDSCs功能差异。监测对照组、对照-MDSCs转输组、TPO-RA-MDSCs转输组及(TPO-RA+TGF-β1)-MDSCs转输组的血小板数量变化;流式细胞术检测各组小鼠胸腺、淋巴结及脾脏中CD4+细胞和CD8+细胞，淋巴结及脾脏中CD19+细胞驻留GO期的比例;流式细胞术检测各组小鼠脾脏Th1、Th2、Th17及Treg细胞比例，细胞毒性T细胞功能分子表达水平，B细胞分化及抗体产生水平。<br>　　5.体外诱导人MDSCs及指标检测:分离健康对照及ITP患者的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），加入白细胞介素-6和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子进行人MDSCs的体外诱导培养。设置不同浓度的TPO-RA干预组，流式细胞术检测各组MDSCs比例;免疫磁珠分选对照组及TPO-RA干预组MDSCs，提取RNA后qRT-PCR检测各组功能分子表达;ELISA检测细胞培养上清中TGF-β1水平。<br>　　结果:<br>　　1.TPO-RA治疗后ITP患者MDSCs比例升高，且与血小板数呈正相关<br>　　ITP患者TPO-RA治疗后MDSCs比例显著高于治疗前比例（P＜0.01）;相关性分析提示患者外周血MDSCs比例与血小板数呈正相关（P=0.0049，R2=0.4435）。<br>　　2.TPO-RA通过TGF-β1提高被动型ITP小鼠的骨髓MDSCs比例<br>　　在被动型ITP小鼠模型中，TPO-RA治疗组小鼠血小板数和MDSCs比例显著高于对照组(P＜0.01)，而当TPO-RA与TGF-βi合用时，TPO-RA对MDSCs比例的提高作用被抑制。<br>　　3.TPO-RA通过TGF-β1提高主动型ITP小鼠的骨髓MDSCs比例和Arg-1表达水平<br>　　在主动型ITP小鼠模型中，TPO-RA治疗组小鼠血小板数、MDSCs比例、Arg-1表达水平及血清TGF-β1水平均显著高于对照组(P＜0.01)，而当TPO-RA与TGF-βi合用时，TPO-RA的作用均被抑制。<br>　　4.主动型ITP小鼠血清TGF-β1水平与骨髓MDSCs比例呈正相关<br>　　主动型ITP小鼠血清TGF-β1水平与血小板数呈正相关(P＜0.0001，R2=0.6476);骨髓MDSCs比例与血小板数呈正相关(P=0.0016，R2=0.3449);骨髓MDSCs比例与血清TGF-β1水平呈正相关(P＜0.0001，R2=0.5332)。<br>　　5.TPO-RA通过TGF-β1增强主动型ITP小鼠MDSCs功能<br>　　5.1TPO-RA通过TGF-β1增强MDSCs促进CD4+及CD19+细胞驻留在G0期的功能<br>　　在MDSCs细胞治疗模型中，TPO-RA-MDSCs治疗组小鼠脾脏CD4+及CD19+细胞驻留在G0期的比例显著高于对照-MDSCs治疗组(P＜0.01;P＜0.05)，而(TPO-RA+TGF-β1)-MDSCs的作用弱于TPO-RA-MDSCs。<br>　　结论:<br>　　1.TPO-RA促进ITP患者MDSCs扩增。<br>　　2.TPO-RA可通过提高血小板数，进而升高血清TGF-β1水平，间接促进MDSCs扩增及免疫抑制功能改善。<br>　　3.TPO-RA可通过TGF-β1-Smad2/smad3通路直接增强MDSCs功能。<br>　　综上所述，TPO-RA可通过间接作用和直接作用共同促进MDSCs扩增并改善其免疫功能，TGF-β1在其中发挥了关键作用。<br>　　第二部分 乙肝核心抗体阳性在ITP中的临床意义探究<br>　　目的:<br>　　1.探究ITP患者anti-HBc阳性比例及乙肝病毒再激活可能性。<br>　　2.探究anti-HBc血清学状态对ITP疾病严重程度的影响。<br>　　3.探究anti-HBc血清学状态对ITP相关治疗疗效的影响。<br>　　方法:<br>　　1.回顾性收集2009年1月至2019年1月在山东大学齐鲁医院血液科住院的ITP患者资料。通过病例系统对患者的临床信息进行检索，记录患者年龄、性别、疾病分期、血小板数、出血评分、巨核细胞数、既往用药、住院天数、肝功、乙肝五项结果等资料并进行统计分析。计算乙肝表面抗原阴性患者中，anti-HBc阳性患者所占比例，并比较anti-HBc阳性组和anti-HBc阴性组之间临床特征的差异。<br>　　2.收集2013年7月至2016年12月期间参与本研究中心临床试验(NCT01734044)的ITP患者病例资料;回顾性收集自2014年12月至2019年1月在山东大学齐鲁医院血液科住院并使用利妥昔单抗治疗的ITP患者的病例信息，严格按照纳入和排除标准选择患者入组，结合病例资料和电话随访进行疗效记录，分析比较anti-HBc阳性组和阴性组患者药物治疗效果的差异。<br>　　3.记录病例收集过程及随访过程中发现的乙肝病毒再激活病例情况。<br>　　结果:<br>　　1.ITP患者中anti-HBc阳性比例达51.03％，且阳性比例随年龄增长而递增。<br>　　自2009年1月至2019年1月，共计725例ITP患者纳入统计分析。其中anti-HBc阳性组患者占51.03％(n=370)，anti-HBc阴性组患者占48.97％(n=355)。按照年龄对患者进行分组，结果示20岁及以下、21-30、31-40、41-50、51-60、61-70及70岁以上患者中anti-HBc阳性比例分别为47％、42％、45％、54％、54％、60％及66％，总体趋势为anti-HBc阳性比例随年龄增长而递增。<br>　　2.anti-HBc阳性组患者疾病严重程度重于anti-HBc阴性组。<br>　　与anti-HBc阴性组相比，anti-HBc阳性组患者血小板数更低，出血评分更高，住院时间更长(P＜0.01;P＜0.05;P＜0.01)。<br>　　3.anti-HBc阳性组患者对药物治疗的初始完全反应率低于anti-HBc阴性组。<br>　　Anti-HBc阳性组患者的初始完全反应率(CR)显著低于anti-HBc阴性组患者(45.2％v59.8％，P＜0.05);用logistic回归模型调整可能影响药物疗效的其它因素后，结果示anti-HBc阳性组比anti-HBc阴性组达到初始完全反应的可能性更低(OR=0.556，95％CI:0.329-0.983)。亚组分析结果提示，anti-HBc阳性对药物疗效的不良影响在疾病程度更为严重的患者中体现的更为明显。<br>　　结论:<br>　　1.ITP患者anti-HBc阳性比例达51.03％，且阳性比例随年龄增长而递增。<br>　　2.与anti-HBc阴性组相比，anti-HBc阳性组患者疾病状态更严重，具体表现为血小板数更低，出血评分更高，住院时间更长。<br>　　3.与anti-HBc阴性组相比，anti-HBc阳性组患者对免疫抑制治疗的初始完全反应率更低，且在疾病程度更严重的患者中体现的更明显。<br>　　4.在接受标准剂量利妥昔单抗治疗的ITP患者中，anti-HBc阳性组比anti-HBc阴性组患者复发风险更高。<br>　　5.Anti-HBc阳性的ITP患者在接受大剂量地塞米松冲击治疗后存在乙肝病毒再激活风险。