苯乙双胍通过调控口腔鳞癌细胞外泌体microRNA--1246及microRNA--205水平抑制血管生成-论文-万方医学网

苯乙双胍通过调控口腔鳞癌细胞外泌体microRNA--1246及microRNA--205水平抑制血管生成

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摘要研究背景 　　口腔鳞状细胞癌（oralsquamouscellcarcinoma,OSCC)是最为易发的口腔恶性肿瘤类型之一，尽管目前口腔鳞状细胞癌的治疗手段众多，如手术切除原发及转移的病变组织;放疗及化疗等方式缩小病灶;同时配合中医中药疗法及加强营养等方式提高患者生存质量及预后疗效，但口腔鱗状细胞癌的治疗仍然是临床上亟需解决的难题。随研究的进一步深入，发现除口腔鳞癌细胞基因的变化与癌症演变具有密切的关系外，肿瘤微环境在口腔鳞癌演变及血管生成中所发挥的作用不容忽视。外泌体（Exosomes,Exo),由细胞分泌的微小囊泡，其在细胞间沟通发挥重要的桥梁作用。肿瘤细胞来源的外泌体富含microRNA、DNA、蛋白等遗传物质，也是肿瘤微环境中重要的组分，其中外泌体中的microRNA在调控肿瘤演变、血管生成、肿瘤耐药等过程中发挥着重要的作用，探讨通过调控肿瘤细胞外泌体的分泌及成分在抗癌中的作用是目前研究的一大热点。研究已发现治疗糖尿病常用药二甲双胍（Metformin)具有广泛的抗癌作用，而且近期研究显示二甲双胍可通过影响肿瘤细胞的外泌体合成与分泌调控肿瘤细胞的生长。然而越来越多的研究发现另一双胍类降糖药物苯乙双胍（Phenformin)抗癌效果明显优于二甲双胍，而且发现苯乙双胍亦可通过肿瘤微环境发挥抑制血管生成的作用，但具体机制有待研究。鉴于以往的研究主要聚焦于苯乙双胍在肿瘤细胞中的直接作用，在肿瘤微环境调控的作用研究甚少，而且苯乙双胍调控口腔鳞癌细胞的作用尚未见报道。因此本研究将口腔鳞癌细胞作为研究对象，探讨苯乙双胍是否通过改变肿瘤微环境，如调控口腔鳞癌细胞分泌的外泌体发挥抑制血管内皮细胞生成血管的作用及其潜在的分子机制。 　　实验目的 　　(1)研究苯乙双胍抑制口腔鳞癌细胞增殖的作用。 　　(2)探究苯乙双胍刺激口腔鳞癌细胞分泌的外泌体在人脐静脉血管内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcells,HUVECs)生物学行为如增殖、迁移能力的影响及在体外血管生成中的作用。 　　(3)探究苯乙双胍剌激口腔鱗癌细胞分泌的外泌体在体内对血管生成的影响。 　　(4)阐明苯乙双胍刺激的口腔鳞癌细胞分泌的外泌体影响血管内皮细胞血管生成的分子机制。 　　实验方法 　　(1)分别通过CCK8实验及EdU细胞增殖试剂盒，探究苯乙双胍及二甲双胍在口腔鳞癌细胞增殖中的作用。 　　(2)通过透射电镜、纳米粒子跟踪分析技术、WesternBlot技术对外泌体的形态、直径、表面标记进行鉴定，通过PKH67绿色染料标记外泌体使其呈现绿色荧光并加入HUVECs培养基内进行摄取实验检测外泌体是否可进入HUVECs内。 　　(3)等体积的生理盐水（PBS)及终浓度1mM苯乙双胍（Phenformin,Phen)分别处理口腔鳞癌细胞，48h后收集细胞上清液，提取外泌体（Exosomes,Exo):即PBS-Exo组和Phen-Exo组。将上述两组外泌体分别处理HUVECs,通过CCK8实验、Transwell小室实验及细胞划痕实验检测其对HUVECs增殖及迁移能力的影响;随后通过体外管腔形成实验于体外分析苯乙双胍刺激口腔鳞癌细胞分泌的外泌体对血管生成的影响。 　　(4)通过体内移植HUVECs裸鼠皮下成血管实验和鸡胚绒毛尿囊膜血管实验分析苯乙双胍刺激口腔鳞癌细胞分泌的外泌体在体内对血管生成的影响。 　　(5)通过外泌体microRNA测序分析筛选和鉴定潜在的影响血管生成的关键microRNA,并通过实时定量PCR(qRT-PCR)进行验证。 　　(6)在HUVECs中过表达和低表达所鉴定的关键microRNA,通过体外管腔形成实验检测其对血管生成的调控作用，通过qRT-PCR及WesternBlot技术从基因（mRNA)和蛋白水平来检测其作用下游靶基因。 　　实验结果 　　(1)与对照组及二甲双胍组相比，苯乙双胍在抑制口腔鳞癌细胞的增殖方面效果更显著。 　　(2)苯乙双胍刺激的口腔鳞癌细胞分泌的条件培养基具有抑制HUVECs生成血管的作用，而加入外泌体抑制剂可抵消抑制血管生成的作用。 　　(3)透射电镜观察外泌体呈典型的茶托形态、纳米粒子跟踪分析技术分析外泌体直径在100nm-150nm之间、WesternBlot检测显示囊泡表达外泌体特异蛋白:CD81、CD63、TSG101在HUVECs摄取外泌体实验中，绿色荧光染料PKH67标记的外泌体可进入HUVECs内。 　　(4)与PBS-Exo组相比，Phen-Exo组外泌体在体外可以显著抑制HUVECs的增殖、迁移，且在体外和体内实验中具有抑制血管生成的作用。 　　(5)外泌体microRNA测序分析鉴定出Phen-Exo组外泌体高表达与血管生成相关的microRNA-1246(miR-1246)及microRNA-205(miR-205)，并通过qRT-PCR技术进行验证。 　　(6)在HUVECs内高表达miR-1246及miR-205具有抑制血管生成的作用，同时可显著降低血管生成关键因子VEGFA的表达;而在HUVECs内低表达miR-1246及miR-205时，血管生成及VEGFA的表达情况与之相反。 　　结论 　　本研究发现，苯乙双胍抑制口腔鳞癌细胞的增殖能力疗效更佳。苯乙双胍刺激口腔鳞癌细胞分泌的外泌体在体外显著抑制人脐静脉血管内皮细胞的增殖和迁移，体外管腔实验、裸鼠皮下成血管实验及鸡胚绒毛尿囊膜血管实验均表明苯乙双胍剌激口腔鳞癌细胞分泌的外泌体在体内及体外均可显著抑制血管的生成。探讨作用机理，研究发现苯乙双胍刺激口腔鳞癌细胞分泌的外泌体中miR-1246及miR-205表达明显升高，且血管内皮细胞中miR-1246及miR-205表达升高可显著抑制其形成血管的能力，并降低血管生成因子的表达。总之，本研究首次揭示了苯乙双胍可通过调控口腔鳞癌细胞分泌的外泌体中miR-1246及miR-205的水平发挥抑制血管内皮细胞生成血管的作用，提示了苯乙双胍具有潜在改变肿瘤微环境进而抑制血管生成的作用，为研发治疗口腔鳞癌的新策略提供了理论基础。