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摘要背景和目的<br>　　随着人口老龄化社会的到来，糖尿病已经成为了全球性的公共健康问题而亟待解决。该疾病可诱发以骨量减少、骨微结构受损、骨脆性增加为特征的代谢性骨病，即糖尿病性骨质疏松症。由于该类型骨质疏松的发生与糖代谢紊乱密切相关，故如何降糖并改善骨微结构成为治疗该疾病的关键。作为长效降糖药物，艾塞那肽（Exendin-4,Ex-4)在降低血糖的同时可有效改善血脂代谢，目前已成为糖尿病临床治疗药物的重要选择;艾地骨化醇（Eldecalcitol，ED-71)，作为近期将在我国临床上市应用的抗骨质疏松药物，可有效增加骨密度、维持骨代谢平衡，是改善和治疗骨质疏松的前景药物。然而，上述两种药物的联合应用对糖尿病性骨质疏松的治疗效果有待确定，其相关作用机制有待进一步探究。本课题旨在探讨Ex-4和ED-71的联合应用对糖尿病性骨质疏松症的治疗效果及相关作用机制，预期成果将为糖尿病性骨质疏松的临床治疗提供新的思路。<br>　　材料和方法<br>　　1.采用C57BLKS/JIar-+Lerdb/+Lerdb(db/db)小鼠建立糖尿病性骨质疏松动物模型，并随机分为CON、Ex-4、ED-71、Ex-4+ED-71组，其中Ex-4的给药标准为10μg/kg,皮下注射，每天一次;ED-71的投药剂量为0.25μg/kg,灌胃处理，每周三次。在治疗过程中，每4天检测一次空腹血糖水平。为期4周治疗后，通过MicroCT、HE染色观察骨组织形态学变化;利用免疫组化检测骨形成标志物的表达情况。综合评价糖尿病所致的骨组织病理学改变、评价联合用药对糖尿病性骨质疏松的治疗效果。<br>　　2.采用免疫组化、RT-qPCR及ELISA检测db/db小鼠体内M2巨噬细胞极化情况。使用Ex-4或/和ED-71处理RAW264.7,通过细胞免疫荧光、流式细胞术及RT-qPCR评估RAW264.7的极化类型。随后，提取小鼠骨组织的BMSCs,构建RAW264.7及BMSCs的共培养体系。通过结晶紫染色、碱性磷酸酶染色及茜素红染色评估BMSCs的迁移及成骨分化能力。综合评价联合用药后巨噬细胞的极化类型，以及巨噬细胞与骨髓间充质干细胞之间的通讯在联合用药改善糖尿病性骨质疏松过程中所发挥的作用。<br>　　3.通过相关文献综合分析，PI3K/AKT信号通路可能在Ex-4与ED-71联合应用促进巨噬细胞极化过程中发挥重要作用，并通过相关体外实验进行验证。体外培养RAW264.7,给予Ex-4或/和ED-71刺激，通过WesternBlot检测该信号通路的蛋白表达情况。随后，在Ex-4或/和ED-71作用的前提下，给予PI3K抑制剂（LY294002)及AKT抑制剂（ARQ092)处理，通过WesternBlot、RT-qPCR及ELISA检测该信号通路的转导情况。此外，在构建的RAW264.7与BMSCs共培养体系中给予LY294002及ARQ092,通过结晶紫染色、碱性磷酸酶染色及茜素红染色评估BMSCs的迁移及成骨分化能力。<br>　　结果<br>　　1.联合应用Ex-4及ED-71可显著增加db/db小鼠的骨量，其骨体积分数、骨小梁数量及骨小梁厚度显著增加、骨小梁分离度显著减少，成骨效果明显强于单一用药。Ex-4或ED-71可增加碱性磷酸酶（ALP)及Ⅰ型胶原蛋白（ColⅠ)的免疫反应性，联合用药可更为显著地增加上述骨形成标志物的免疫反应性。此外，血糖异常升高的db/db小鼠经ED-71治疗后，血糖水平降低，且联合用药组的血糖降低程度明显优于单一用药组。<br>　　2.联合用药处理的db/db小鼠骨组织中M2巨噬细胞标志物CD206及TGF-β1的免疫反应性显著增加，且M2巨噬细胞标志物CD163及CD206mRNA的表达水平显著增加，而M1巨噬细胞标志物IL-1β及iNOSmRNA的表达水平显著降低。此外，联合用药处理的db/db小鼠血清中TGF-β1分泌增多，而IL-1β分泌减少。与单一用药相比，联合应用Ex-4与ED-71可显著增加RAW264.7的CD163及CD206免疫荧光强度，大幅度提高F4/80+CD206+细胞的比例。在共培养体系中，联合用药组的结晶紫染色、碱性磷酸酶染色及茜素红染色的阳性表达区域显著增加。<br>　　3.与单一用药相比，联合用药可显著增加RAW264.7的磷酸化PI3K和AKT水平，给予LY294002及ARQ092刺激后，PI3K和AKT的磷酸化水平受到显著抑制。此外，联合应用Ex-4和ED-71可显著增加TGF-β1的表达和分泌，在加入LY294002或ARQ092后，TGF-β1的表达和分泌受到显著抑制。在施加LY294002与ARQ092的共培养体系中，联合用药组的结晶紫染色、碱性磷酸酶染色及茜素红染色的阳性表达区域显著减少。<br>　　结论<br>　　1.Ex-4与ED-71协同促进糖尿病性骨质疏松小鼠的新骨形成并降低其血糖水平。<br>　　2.Ex-4与ED-71联合应用促进M2巨噬细胞极化并诱导BMSCs成骨分化。<br>　　3.Ex-4与ED-71通过PI3K/AKT信号通路协同促进M2巨噬细胞极化诱导BMSCs成骨分化。