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摘要研究背景:<br>　　急性髓系白血病(acutemyelocyticleukemia，AML)是一类来源于造血系统的肿瘤疾病。阿糖胞苷联合蒽环类化疗药物的“7+3”方案是除了急性早幼粒细胞白血病外的其它类型AML的标准诱导化疗方案，大剂量阿糖胞苷是AML缓解后的治疗优选巩固方案。这些化疗方案虽然可获得较高的缓解率，但仍存在患者复发率高、生存率低等问题。其原因与部分白血病细胞对传统抗肿瘤药物敏感性下降，或者传统抗肿瘤药物副作用多，导致治疗延迟或中断有关。因此，有必要开发抗白血病效果好同时对正常细胞毒性低的药物。<br>　　化合物库由特定结构或生物学安全性好的小分子化合物构成。化合物库的筛选是新药开发及新适应症探索的重要方法，也是探索AML新治疗药物的有效途径。<br>　　近些年来发现细胞代谢异常与肿瘤发生发展相关。线粒体作为细胞代谢的中心，参与了几乎所有细胞的能量代谢。活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)是线粒体代谢产生的重要物质，当线粒体发生代谢紊乱时，细胞内部的活性氧含量上升会诱发氧化还原稳态失衡、氧化应激等线粒体损伤相关的一系列变化。研究发现肿瘤细胞ROS异常升高且对ROS敏感度也增高。异常升高的ROS通过氧化肿瘤细胞中的生物大分子、氧化平衡失调等，引起DNA损伤、肿瘤组织的微血管损伤、恶性细胞凋亡率升高等发挥抑制肿瘤活性作用。研究发现AML细胞等恶性肿瘤细胞具有独特的线粒体特征，如ATP储存量下降，对氧化磷酸化的依赖性增加。因此，探索AML特异性线粒体代谢的改变、进而挖掘抑制线粒体异常氧化磷酸化的化合物成为干预AML的新策略。<br>　　阿糖胞苷(Ara-C)属于胞嘧啶类似物抗肿瘤药物，广泛用于AML诱导缓解、巩固强化等治疗阶段。然而，阿糖胞苷尤其是大剂量阿糖胞苷存在骨髓抑制、肝毒性等毒副作用。因此，探索通过增加阿糖胞苷敏感性、减少其用药剂量、增加其安全性成为AML治疗的临床关切。<br>　　研究目的<br>　　(一)通过大规模化合物库的筛选，筛选出新型线粒体解偶联剂BAM15，并验证其生物学效应，探讨其作用机制。<br>　　(二)通过BAM15与阿糖胞苷在体外及体内的联合应用，验证两者之间的协同效应，探讨BAM15对传统化疗药物阿糖胞苷的增敏作用。<br>　　方法和结果<br>　　(一)通过小分子化合物库筛选出线粒体解儡联剂BAM15<br>　　对化合物库中4704种化合物进行筛选:将三种AML细胞系(U937、Kasumil和THP1)分别与10μM小分子化合物共同孵育72小时，通过CCK-8法检测急性髓系白血病细胞活性。最终鉴定出线粒体解偶联剂BAM15对三种AML细胞系增殖的抑制率均大于90％。经文献查阅，未发现BAM15在白血病领域中的研究报道。<br>　　(二)新型线粒体解儡联剂BAM15通过诱导ROS的生成抑制白血病细胞增殖和促进白血病细胞凋亡<br>　　1.BAM15显著抑制AML细胞系增殖:通过CCK8、EdU和克隆形成等细胞增殖实验研究BAM15对AML细胞系增殖的影响，并进行BAM15和传统线粒体解偶联剂CCCP、FCCP作用于AML细胞系与CD34+造血祖细胞(CD34+HPCs)后增殖能力的比较。结果显示:BAM15可以显著抑制AML细胞系的增殖能力，较传统的线粒体解偶联剂抗肿瘤能力更强，对正常造血祖细胞毒性小，因而安全性更好。<br>　　2.筛选BAM15引起的细胞死亡的原因:分别应用死亡途径抑制剂，包括铁死亡抑制剂Fer-1和Lipro、坏死通路抑制剂Necro和凋亡通路抑制剂ZVAD-FMK来筛选BAM15抗白血病作用的方式，发现ZVAD-FMK可以有效回复BAM15的抗AML作用，表明凋亡是BAM15引起AML细胞死亡的主要原因。用流式细胞术和WesternBlotting检测应用BAM15后引起AML细胞的凋亡作用及凋亡分子Bcl-2、Bax、PUMA、NOXA等的表达变化，结果表明BAM15处理后AML细胞凋亡水平明显增强，Bax分子量升高，而Bcl-2分子量下降。<br>　　3.BAM15对线粒体功能的影响:用流式细胞仪检测BAM15作用于白血病细胞系后ROS生成和细胞膜电位的变化，同时测定BAM15作用后ATP产生的变化。发现BAM15可以显著提高AML细胞系中ROS水平，降低AML细胞系MMP水平，同时减少ATP的生成。<br>　　4.BAM15通过干扰ROS平衡影响AML细胞活性:将氧化清除剂NAC和BAM15共同作用于AML细胞系，用流式细胞术、CCK8、EdU、WesternBlotting等方法验证在ROS水平改变后BAM15作用于AML细胞系引起效应的变化。结果发现，NAC与BAM15联合应用后，AML细胞中ROS生成减少，细胞膜电位上升、凋亡水平减弱、增殖活性增高。表明ROS平衡改变是BAM15引起AML生物学变化的原因。<br>　　5.BAM15在体内的抗白血病增殖活性:将1×106C1498鼠源性白血病细胞注入C57小鼠尾静脉建立C1498白血病模型。分别通过向对照组和实验小鼠腹腔注射PBS或BAM15，通过白细胞计数、骨髓细胞学检查、肝脾称重、HE染色、Kaplan-Meier生存分析等方法验证BAM15在体内的抗白血病效应。结果表明:BAM15可以显著抑制AML模型组小鼠的白细胞及原始细胞数量，减轻肿瘤细胞浸润，延长白血病小鼠的生存时间。<br>　　6.BAM15抑制初诊AML患者原代细胞的活性:采集初诊急性髓系白血病非M3型患者的骨髓和正常志愿者的脐带血，并分别从中提取原代细胞或CD34+HPCs，验证在BAM15作用下细胞凋亡与活性的变化。结果表明，BAM15可以显著抑制AML原代细胞的活性，增加其凋亡率。但BAM15对CD34+HPCs的活性和凋亡率影响较小。<br>　　(三)BAM15与阿糖胞苷(Ara-C)在干预急性髓系白血病中具有协同作用<br>　　1.BAM15与Ara-C具有协同作用:在AML细胞系U937和Kasumi1细胞中单独或联合应用BAM15和Ara-C，根据Chou-Talalay公式使用Compusyn软件进行两者之间协同效应分析，结果表明Ara-C与BAM15联合有协同抗急性髓系白血病细胞活性的作用。<br>　　2.BAM15与Ara-C联合干预AML细胞增殖与凋亡:实验分为AML模型组(Vehicle)、BAM15组、Ara-C组，BAM15+Ara-C组。然后通过克隆形成和EdU方法检测各组AML细胞活性变化。通过FCM和WesternBlotting检测AML细胞凋亡率和凋亡分子变化。研究结果发现BAM15联合Ara-C较单独应用组能更强抑制AML细胞增殖、协同促进AML细胞凋亡作用。<br>　　3.BAM15与Ara-C通过DNA损伤协同干预AML:BAM15、Ara-c单独或者联合应用于AML细胞系后，检测DNA损伤相关分子的表达量，发现它们都可以明显促进DNA损伤分子r-H2AX，p-ATM、p-ATR等分子的表达量，且联合应用组能引起更强的DNA损伤。<br>　　4.BAM15与Ara-C在体内的协同作用:通过尾静脉注射C1498细胞建立C1498小鼠白血病模型，比较AML模型(Vehicle)组、BAM15组、Ara-C组、BAM15联合Ara-C组的白细胞、骨髓原始细胞、肝脾大小及重量、小鼠生存时间的差异。结果发现BAMl5与Ara-C联合应用组较单独应用组可以更显著抑制白细胞及骨髓原始细胞的数量，减轻肝脾的肿瘤浸润，延长小鼠的生存时间。<br>　　5.BAM15与Ara-C在AML原代细胞中的协同作用:BAM15、Ara-C单独或者联合作用于初诊AML患者骨髓原代细胞后，分别检测细胞增殖、细胞凋亡水平、Bax和Bcl-2的变化。结果表明，BAM15联合阿糖胞苷处理组与单独处理组相比较，可以更显著抑制AML原代细胞活性，同时促进AML原代细胞凋亡水平增高。<br>　　研究结论<br>　　(一)通过小分子化合物库筛选发现具有抑制AML细胞活性作用的线粒体解偶联剂BAM15<br>　　通过细胞分子水平试验发现BAM15作用于白血病细胞通过诱导线粒体ROS的生成，干扰氧化平衡，导致线粒体细胞膜电位下降，促进细胞凋亡，阻碍细胞增殖。小鼠体内研究发现BAM15可以延缓AML模型小鼠肿瘤细胞的生长，延长C57小鼠生存时间。表明BAM15是一种有前景的干预AML的化合物。<br>　　(二)BAM15与阿糖胞苷(Ara-C)在千预急性髓系白血病中具有协同作用<br>　　在AML细胞系、原代细胞和小鼠体内的研究证明BAM15联合Ara-c较两者单独应用能更好地抑制肿瘤活性。其机制与两者联合应用能更显著促进DNA损伤分子r-H2AX、p-ATM、p-ATR的表达，协同增加DNA损伤相关。