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摘要目的：<br>　　1.鉴定AAS促LDL吞噬作用的细胞生物学特征。<br>　　2.探索AAS调节LDLR细胞内转运的机制。<br>　　3.在动物模型中探讨AAS促LDL吞噬作用的病理生理学意义。<br>　　方法：<br>　　第一部分 鉴定AAS促LDL吞噬作用的细胞生物学特征<br>　　1.1 AAS对HepG2细胞摄取LDL的影响:体外培养人肝癌细胞系HepG2，首先加入DiI荧光标记的LDL（DiI-LDL，10μg/mL）并给予AAS处理，荧光显微镜以及流式细胞术检测不同时间点(15、30、60、120、240min)后细胞对LDL的摄取;接下来通过荧光显微镜检测不同强度的AAS（培养基含100％、75％、50％、25％、0％正常水平的氨基酸）对细胞摄取LDL的影响。<br>　　1.2 AAS诱导细胞摄取LDL作用的特异性:体外培养HepG2细胞，检测氨基酸回补(replenish)是否能逆转AAS培养基处理对细胞摄取LDL的影响;接下来给予细胞血清剥夺或是葡萄糖剥夺处理1h，检测不同营养剥夺条件对细胞摄取LDL的影响。<br>　　1.3 AAS的促吞噬作用与自噬的关系:用Rapamycin（5μM）刺激HepG2细胞0、0.5、1、2h，通过免疫蛋白印迹以及荧光显微镜检测自噬相关蛋白LC3B的表达以及细胞摄取LDL的变化;沉默Atg5表达后检测AAS对细胞摄取LDL的影响是否改变。。<br>　　1.4 AAS的促吞噬作用与LDLR介导的内吞途径的关系:提取并培养野生型(WT)以及LDLR-/-小鼠的原代肝脏细胞及脂肪间充质干细胞，给予AAS处理1h，荧光显微镜检测细胞对LDL的摄取情况。<br>　　1.5AAS的促吞噬作用与LDLR基因表达的关系:首先对HepG2细胞用AAS处理0、30、60、120min，通过免疫蛋白印迹以及实时定量PCR的方法分别检测LDLR的蛋白和mRNA的表达;分别用actinomycin D(10μg/mL)和cycloheximide(30μg/mL)预处理4h阻断细胞内mRNA和蛋白合成途径，然后检测AAS对细胞LDL摄取的作用有何变化。<br>　　1.6 AAS的促吞噬作用与LDLR在细胞膜表面分布的关系:HepG2细胞用AAS处理不同时间点，通过生物素化细胞膜蛋白、免疫荧光和流式细胞术的方法检测AAS对细胞膜表面LDLR丰度的影响。<br>　　第二部分 探索AAS调节LDLR转运的机制<br>　　2.1 AAS对LDLR细胞内空间分布的影响:在NIH-3T3细胞中，首先使用免疫荧光检测AAS对LDLR在细胞内空间分布的影响;用免疫荧光双标实验检测LDLR与Rab4、Rab11、EEA1、Rab5、Rab7以及Vps35的共定位情况。<br>　　2.2 AAS对胞内LDLR再循环(recycbng)速率的影响:NIH-3T3细胞用AAS处理，通过生物素标记追踪实验，检测AAS对胞内LDLR再循环速率的影响。<br>　　2.3 AAS的作用与Rab4介导的快循环通路之间的关系:构建Rab4激活突变体（constitutively active mutant）Rab4a-Q67L、Rab4失活突变体(dominant negative mutant)Rab4a-S22N以及Rab4野生型(wild type)Rab4a-WT三种质粒。在NIH-3T3细胞中转染不同质粒后检测AAS作用的变化。基因沉默Ra4a后检测AAS对LDL摄取的影响有何变化:最后通过免疫荧光双标实验检测转染不同Rab4a质粒后LDLR与Rab4a在细胞内的分布和共定位情况。<br>　　2.4 AAS的作用与GCN2信号通路的关系:首先在HepG2细胞中敲低GCN2的表达，然后用荧光显微镜检测AAS的促LDL吞噬作用有何变化;其次用不同浓度的GCN2的竞争性抑制剂GCN2iB（0、1、2μM）处理NIH-3T3细胞4h，然后检测AAS的促LDL吞噬作用有何变化。<br>　　2.5 AAS的作用的分子机制<br>　　2.6 CaMKⅡ介导的Rab4a磷酸化在AAS作用中的角色<br>　　2.7 Rab4a磷酸化在AAS作用中的角色:NIH-3T3细胞内分别过表达Rab4a-WT或Rab4a-T137A，荧光显微镜检测AAS对细胞LDL摄取的作用有何变化;利用生物素化膜蛋白实验收集细胞膜蛋白，用蛋白免疫印迹检测AAS对细胞膜表面LDLR丰度的作用有何变化。<br>　　2.8 AAS对Rab4a-Rebenosyn-5相互作用的影响:NIH-3T3细胞中外源性表达Rab4a-WT和Rab4a-T137A，给予AAS处理1h，免疫沉淀法检测Rab效应蛋白Rebenosyn-5与野生型Rab4a和Rab4a-T137A突变体的相互作用及AAS的影响。用KN-93(5μM)预处理表达Rab4a-WT的细胞4h，检测AAS对Rab4a-Rebenosyn-相互作用的影响有何变化。<br>　　第三部分 在动物模型中探讨AAS促LDL吞噬作用的病理生理学意义<br>　　3.1 急性膳食氨基酸剥夺对小鼠血液LDL-C清除的影响及机制<br>　　3.2 限制膳食蛋白摄入对小鼠高胆固醇血症的影响<br>　　结果：<br>　　第一部分 鉴定AAS促LDL吞噬作用的细胞生物学特征<br>　　1.1 AAS促进HepG2细胞摄取LDL<br>　　1.2 AAS诱导细胞摄取LDL作用的特异性<br>　　1.3 AAS促吞噬作用不依赖于自噬途径<br>　　1.4 AAS促吞噬作用依赖于LDLR介导的内吞途径<br>　　1.5 AAS促吞噬作用不依赖于上调LDLR的表达途径<br>　　1.6 AAS促进细胞摄取LDL的作用依赖于增加LDLR在细胞膜表面的分布<br>　　第二部分 探索AAS调节LDLR转运的机制<br>　　2.1 AAS调控LDLR在细胞内的空间分布:免疫荧光检测显示，在静息状态下的细胞中绝大部分的LDLR分布在核周围区域，AAS刺激促使LDLR远离核周，呈现出向胞浆发散分布的趋势。分布于细胞核周围的LDLR与Rabll以及Rab4均显示出有共定位，提示静息状态下LDLR主要分布于核周的ERC区域。免疫双标结果显示AAS增加了LDLR与Rab5、EEA1以及Rab4在远离细胞核的胞浆区域中的共定位。与此相反，LDLR与Rab7和Vps35的共定位不受AAS处理的影响。<br>　　2.2 AAS增加LDLR的循环速率:用生物素标记实验直接检测LDLR再循环速率的实验发现AAS刺激加快了胞浆中LDLR返回至细胞膜表面的速度（从峰值降至基线的速度），同时AAS也加快了细胞膜表面LDLR内化至胞浆中的速度（从基线上升至峰值的速度）。<br>　　2.3 AAS的作用依赖于Rab4介导的快循环通路:过表达Rab4a-S22N(dominant negative)可以抑制AAS的促吞噬作用;相反，在正常细胞中过表达Rab4a-Q67L(constitutively active)可以模拟AAS的促吞噬效应。过表达Rab4a-WT对基础状态下的LDL吞噬过程没有影响，但是进一步增强了AAS的促吞噬作用。敲低Rab4a的表达可以削弱AAS的促吞噬作用。外源性表达Rab4a-Q67L后，Rab4a-Q67L与LDLR在胞浆区域呈现大量共定位;相反，外源性表达的Rab4a-S22N仅在核周区域与LDLR呈现部分共定位。<br>　　2.4 AAS的作用的分子机制不依赖于GCN2信号通路:已知AAS能够激活经典的GCN2激酶通路。我们发现敲低GCN2表达或用GCN2抑制剂GCN2iB预处理细胞对AAS的促吞噬作用均没有显著影响。<br>　　2.5 AAS作用的信号传导机制<br>　　2.6 AAS通过CaMKⅡ介导的Rab4a磷酸化而发挥作用<br>　　2.7 AAS的作用依赖于Rab4a的磷醴化:通过荧光显微镜检测过表达Rab4a-WT以及质粒后，AAS对细胞LDL摄取的作用有何变化。结果显示，在NIH-3T3细胞中外源性表达Rab4a-T137A，在表达水平较高的细胞中我们观察到AAS促吞噬的作用被削弱;而在表达水平较低的细胞中，AAS的促吞噬作用依旧明显。蛋白免疫印迹实验显示过表达Rab4a-T137A可以部分阻断AAS增加LDLR在细胞膜表面分布的作用。<br>　　2.8 AAS通过Ca2+/CaMKⅡ介导的信号通路增加Rab4a与Rebenosyn-5结合:免疫共沉淀结果显示AAS刺激可以明显增加Rab4a-WT与Rebenosyn-5的结合，相反AAS不影响Rab4a-T137A与Rebenosyn-5的结合。AAS增加Rab4a-WT与Rebenosyn-5结合的作用可被KN-93抑制。<br>　　第三部分 在动物模型中AAS促LDL吞噬作用的病理生理学意义<br>　　3.1 急性膳食氨基酸剥夺对小鼠血液LDL-C清除的影响及机制<br>　　3.2 限制膳食蛋白摄入对小鼠高胆固醇血症的影响<br>　　结论：<br>　　在细胞水平，氨基酸饥饿应激可触发细胞内LDLR向细胞表面转运，导致LDL内吞作用增强。这种反应是由Ca2+和CaMKⅡ依赖的信号传导途径介导的，该信号可将细胞内LDLR重新分配到快速循环途径。在整体水平，限制膳食蛋白质（氨基酸）摄入可加快肝脏摄取LDL，促进血液中LDL颗粒的清除。在LDLR+/-杂合子小鼠中，限制膳食氨基酸摄入可改善高脂诱导的高胆固醇血症。