检索历史 清除

摘要急性肾损伤(Acutekidneyinjury，AKI)是在较短的时间内突然发生的肾功能快速降低而引起的临床综合征。AKI发病率、死亡率高，且易发展为慢性肾病，缺血再灌注和肾毒性药物是临床上引起AKI的常见致病因素。AKI的病理生理机制相对复杂，目前临床上治疗AKI的患者主要以肾透析为主。因此积极探索AKI的发病机制，实现特异性的靶点治疗具有重要意义。<br>　　iRhom2(inactiverhomboidprotein2，iRhom2，由Rhbdf2基因编码)蛋白作为Rhomboid家族中iRhoms亚家族的一员，属于一种不活跃的菱形丝氨酸蛋白酶。研究表明iRhom2通过参与调控胞内蛋白如肿瘤坏死因子-α-转化酶(Tumornecrosisfactor-α-convertingenzyme，TACE)、干扰素基因刺激蛋白(Stimulatorofinterferongenes，STNG)等从内质网到高尔基体、核周微粒体的运输过程，在关节炎、病原体感染等炎症相关疾病中发挥重要作用。AKI发病机制复杂，越来越多的研究表明炎症在其中发挥重要作用，是否iRhom2参与调控急性肾损伤炎症反应目前尚未见报道。因此本课题主要研究iRhom2在急性肾损伤中的作用，并对机制进行初步探讨，以期找到参与AKI的关键分子，用于AKI的诊断与治疗。<br>　　研究目的:<br>　　1.通过体内动物实验、体外细胞实验及临床标本检测明确iRhom2在急性肾损伤中的表达模式。<br>　　2.通过体内动物实验和体外细胞实验明确iRhom2在急性肾损伤中的作用。<br>　　3.初步探讨iRhom2促进急性肾损伤的机制。<br>　　研究方法与结果<br>　　第一部分:iRhom2在急性肾损伤中的表达显著升高<br>　　1.1iRhom2在缺血再灌注诱导的急性肾损伤模型中表达显著升高<br>　　选用8周龄的雄性C57BL/6J小鼠，双侧肾动脉结扎30分钟，分别再灌注6h、12h、24h、48h构建肾脏缺血再灌注损伤(Ischemiareperfusioninjury，IRI)模型。血清肌酐和尿素氮的结果显示AKI模型构建成功。二代转录组基因测序分析发现在肾脏IRI后iRhoms这一亚家族表达升高，且以Rhbdf2的升高尤为明显。同时实时荧光定量PCR(Real-timequantitativePCR，RT-qPCR)、蛋白免疫印迹法(Westernblot，WB)及免疫组织化学染色(Immunohistochemical-staining，IHC)结果显示，iRhom2的表达呈时间依赖性升高，且在缺血再灌后12h表达相对较高。AQPI(近曲肾小管的标记物)、CalbindinD28K(远曲肾小管标记物)、AQP3(集合管标记物)，与iRhom2的免疫荧光(Immunofluoresce，IF)双标实验发现，肾脏IRI后，iRhom2主要在远曲肾小管中表达升高显著。<br>　　1.2LRhom2在体外模拟的多种缺氧模型中表达显著升高<br>　　体外培养大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)，应用糖氧剥夺(oxygenandglucosedeprivation，OGD)、抗霉素A和2-缺氧葡萄糖(anti-mycinA/2-hypoxicglucose，AA/2-DG)及氯化钴(CoCl2)处理模拟缺氧模型，RT-qPCR及WB的结果显示，iRhom2在体外模拟的多种缺氧模型中表达显著升高。<br>　　1.3iRhom2在顾铂诱导的急性肾损伤模型中表达显著升高<br>　　腹腔注射顺铂(25mg/kg)后，1天、2天、3天取材，血清肌酐和尿素氮的结果表明模型构建成功，RT-qPCR、WB及IHC的结果显示，顺铂注射后不同时间点iRhom2的表达升高，且在2天时表达相对较高。<br>　　1.4iRhom2在急性肾小管坏死的临床切片中表达正着升高<br>　　IHC结果显示，与癌旁组织切片相比，在人的急性肾小管坏死临床切片中发现，肾小管中iRhom2的表达显著升高。<br>　　第二部分:iRhom2在急性肾损伤中的作用研究<br>　　2.1全身敲除Rhbdf2小鼠的构建<br>　　利用Cre-loxp系统构建Rhbdf2-/-小鼠，将带有loxp位点的Rhbdf2纯合雌鼠与带有全身cre酶的dppa3-cre+/-雄鼠交配，最后得到ghbdf2-/-小鼠。提取鼠尾DNA鉴定小鼠基因型，结果显示Rhbdf2全身敲除成功。RT-qPCR及WB检测iRhom2在肾皮质中的敲除效率可达78％。<br>　　2.2肾小管上皮细胞特异性敲除Rhbdf2小鼠的构建<br>　　利用Cre-loxp系统构建肾小管上皮细胞特异性敲除Rhbdf2小鼠cdhl6-cre+/-/Rhbaf2fl/fl(文中结果中标记为KSP-cre/Rhbdf2fl/fl)，提取鼠尾DNA鉴定小鼠基因型，结果显示:KSP-cre/Rhbdf2fl/fl即为肾小管上皮细胞特异性敲除Rhbaf7小鼠，二代转录组基因测序结果分析显示ghbafe外显子4-9敲除成功，进一步用RT-qPCR及IF检测结果表明iRhom2在肾小管上皮细胞的表达显著降低，以上结果表明肾小管上皮细胞敲除Rhbdf2小鼠构建成功。<br>　　2.3Rhbdf2缺失明显改善缺血再灌注诱导的急性肾脏损伤<br>　　将8周龄大的雄性Rhbdf2fl/fl、ghbaf2-/-和KSP-cre/Phdf2fl/fl小鼠，双侧肾脏缺血30min再灌注24h，构建IRI模型，检测各组小鼠的肌酐尿素氮结果发现，全身敲除及肾小管特异性敲除Rhbdf2后，可以明显降低缺血再灌注引起的血清肌酐和尿素氮升高，苏木素-伊红染色(Hematoxylin-eosinstaining，HE)和过碘酸希夫染色(PeriodicAcid-Schiffstaining，PAS)结果显示敲除Rhbaf2能明显改善缺血再灌注引起的肾小管肿胀、刷状缘及细胞核脱落。IHC的结果显示敲除Rhbdf2后能显著降低早期肾脏损伤标记分子:肾脏损伤标记分子-1(Kidneyinjurymolecule-1，Kim-1)和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(Neutropilgelatinase-associatedlipocalin，NGAL)的表达。原位末端转移酶标记技术(TUNEL染色)结果进一步显示，肾脏缺血再灌注后显示TUNEL阳性的细胞明显增多，而敲除Rhbaf2后，肾脏凋亡细胞数明显减少。以上结果表明敲除Rhbdf2能显著改善缺血再灌引起的急性肾损伤，且肾脏IRI后全身敲除Rhbdf2组(Rhbdf2-/-)和肾小管特异性敲除Rhbdf2组(KSP-cre/Rhbdf2fl/fl)相比，肾脏损伤程度无显著差异，提示。肾小管中表达的iRhom2在缺血再灌注损伤中发挥重要作用。<br>　　2.4Rhbdf2的缺失可明显改善顺铂诱导的急性肾损伤<br>　　选用10周龄雄性的Rhbdj2fl/fl和Rhbdf2-/-小鼠，注射顺铂(25mg/kg)构建急性肾损伤模型。血清肌酐、尿素氮检测结果，HE染色、PAS染色，以及NGAL的IHC结果显示，全身敲除Rhbdf2后，可以明显改善顺铂诱导的急性肾损伤。<br>　　第三部分:iRhom2在缺血再灌注诱导的急性肾损伤中的机制研究<br>　　3.1iRhom2通过介导炎症反应加重缺血再灌注引起的急性肾损伤<br>　　通过IHC标记巨噬细胞(CD68)，中性粒细胞(Ly6B)，结果显示Rhbdf2fl/fl小鼠在肾脏IRI后，巨噬及中性粒细胞的浸润明显增多，全身敲除及肾小管特异性敲除Rhbdf2，可显著减少巨噬及中性粒细胞的浸润。RT-qPCR检测TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-1β和IL-18等炎症因子的mRNA表达水平，结果显示与Rhbdf2fl/fl肾脏IRI模型组相比，敲除Rhbdf2后炎症因子的表达水平显著降低。<br>　　体外应用NRK-52E细胞，进行OGD处理模拟肾脏缺血再灌注损伤模型。WB检测结果显示转染siRNA-Rhbdf2后iRhom2的表达抑制率可达58％。乳酸脱氢酶及Caspase-3活性检测结果显示，沉默Rhbdf2后可明显减轻OGD引起的NRK-52E死亡;同时RT-qPCR的结果显示，沉默Rhbaf2后TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-1β和IL-18等炎症因子的的mRNA表达水平显著降低，验证了体内的结果。<br>　　以上结果提示Rhbdf2的缺失可以使得炎症细胞的浸润减少，炎症因子的表达减少，。肾脏缺血再灌注损伤减轻。<br>　　3.2iRhond可能通过参与内质网应激，调控ATF6剪切，加重肾脏缺血再灌注损伤<br>　　内质网应激在急性肾损伤炎症反应中发挥重要作用，WB检测IRI模型中内质网应激信号分子的变化，发现iRhom2参与调控内质网应激信号通路，且以ATF6的信号通路变化最明显，提示iRhom2可能调控ATF6的剪切。体外实验CO-IP的结果发现iRhom2可能通过与ATF6结合调控其剪切过程。Rab9标记内质网，GM130标记高尔基体与iRhom2进行免疫荧光双标实验，发现NRK-52E细胞经OGD刺激后，iRhom2从内质网转位到高尔基体，以上结果提示iRhom2可能主要通过调控ATF6剪切参与内质网应激信号通路，加重肾脏缺血再灌注损伤，而iRhom2的转位是否可协助ATF6从内质网到高尔基体尚需进一步验证。<br>　　结论与创新性:<br>　　1.iRhom2在AKI的临床标本和动物模型中表达升高，通过增加炎症细胞浸润，促进炎症因子表达，加重AKI引起的肾脏损伤。同时发现肾小管上皮细胞特异性敲除Rhbdf2可以明显减轻炎症反应，改善急性肾损伤，与全身敲除Rhbdf2小鼠相比无显著差异，提示肾小管上皮细胞中的iRhom2在急性肾损伤中发挥重要作用。<br>　　2.本研究拓宽了iRhom2的生物学功能认识，发现iRhom2可能主要通过调控ATF6剪切参与内质网应激信号通路，加重肾脏缺血再灌注损伤，这为我们寻找特异性的作用靶点及治疗药物指明了研究方向。