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摘要临近空间(Nearspace)是指海平面以上20-100km的空中领域，该区域具有空气稀薄，臭氧层、紫外辐射、电离辐射、重力波、大气带电等特殊的极端环境条件，与地球生命形成之初和火星特殊条件形成之初非常相近。因此，在临近空间这个特殊的空中领域研究地球生命的耐受性可为揭示地球早期生命起源以及宇宙是否存在生命及其来源提供重要的启示作用。临近空间所处的区域飞机难以上去，而卫星难以下来，受到搭载器、暴露装置和生物学技术等条件的限制，目前对该区域的生物学研究非常少。本论文通过浮空飞行器将多种地表微生物样品载入临近空间复杂的极端环境中进行宇宙辐射和暴露，探究地表微生物在临近空间特殊环境条件下的生存能力和适应机理。主要研究内容和结果如下:<br>　　(1)选取原核微生物中的肠杆菌属、芽孢杆菌属、棒杆菌属以及真核微生物中的酵母属等多种微生物，在实验室检测了菌株的生长特征、样品制备和保存方式。结果显示冷冻干燥样品能够保持较高的活性状态，芽孢杆菌的最佳冻干保护剂为5.0％蔗糖，肠杆菌属、棒杆菌属、酵母属的最佳冻干保护剂为4.7％海藻糖。以浮空飞行器为载荷，在我国内蒙古乌拉特中旗地区(经度108.52，纬度41.57)首次成功完成了临近空间生物暴露实验，生物样品的暴露时长为3h14min，平均飞行的海拔高度为33km。<br>　　(2)从临近空间辐射的生物样品中成功分离出存活的芽孢杆菌，包括枯草芽孢杆菌野生型菌株、产肌苷的枯草芽孢杆菌和产鸟苷的解淀粉芽孢杆菌。其中枯草芽孢杆菌野生型菌株的存活率相对较高，达到2.0±3.14×10-9;产鸟苷的解淀粉芽孢杆菌TA208的存活率为1.5±0.047×10-11，产肌苷的枯草芽孢杆菌BS435的存活率为2.4±0.182×10-11。通过微孔板培养筛选得到25株肌苷产量显著提高的突变菌株(p＜0.05)，45株肌苷产量显著降低的突变菌株(p＜0.05)。对肌苷产量显著变化的突变株进行摇瓶验证，获得两株肌苷产量变化显著的突变菌株:UV435-94肌苷产量为22.35±0.86g/L(p＜0.05)，产量提高了11.6％;UV435-144肌苷产量为16.08±0.31g/L(p＜0.05)，降低19.7％。<br>　　(3)对突变株和原始菌株进行基因组测序分析，结果显示突变株的基因组发生了突变，其中UV435-94菌株的突变基因主要与碳水化合物运输与代谢、基因的转录调控相关;UV435-144菌株的突变基因主要与环境抗逆性、肽聚糖合成相关。转录组学测序结果显示UV435-94菌株差异转录基因富集在细胞膜信号识别、细菌环境信息处理、细胞跨膜转运、芽孢形成和细菌分泌系统;UV435-144菌株差异转录基因富集在细菌环境信息处理、细胞跨膜转运、基因转录调节、芽孢形成和核苷酸代谢等途径。蛋白组学测序结果显示UV435-94菌株的差异蛋白主要富集在细胞膜信号识别、细胞跨膜转运、基因转录调节、芽孢形成、碱基修复和同源重组、嘌呤合成途径和细菌分泌系统;UV435-144菌株的差异蛋白主要富集在细胞膜信号识别、细胞跨膜转运、基因转录调节、芽孢形成、碱基修复和同源重组、嘌呤合成途径及嘧啶合成途径。<br>　　(4)蛋白组学测序结果显示差异蛋白主要富集在糖酵解途径、氨基酸生物合成途径、磷酸戊糖途径、嘌呤核苷的代谢途径及嘧啶核苷的代谢途径。蛋白组学差异表达分析木酮糖激酶XylB(Xylulosekinase)在UV435-94VSBS435组中上调表达。磷酸化蛋白检测结果显示突变株和对照菌株差异磷酸化蛋白为PTS果糖转运体亚基ⅡA和PTS系统-葡糖苷特异性EIIBCA组分在UV435-94VSBS435组上调表达，推测菌株对环境中糖源的利用（比如葡萄糖、木糖、果糖）有利于嘌呤核苷的积累。突变株肌苷产量的提高可能是由于磷酸转移酶系统在转录和蛋白表达水平发生变化，系统调节碳水化合物的代谢，有利于菌株摄取环境中的糖源，促进细菌的生长繁殖及代谢。且嘌呤合成相关基因的蛋白表达水平上调引起肌苷产量的提高。平行反应监测蛋白组学技术(ParallelReactionMonitoring，PRM)进一步验证了嘌呤核苷合成代谢通路的相关基因结果有显著差异。<br>　　(5)突变株UV435-94的转录调控相关基因的突变引起细胞防御等基因转录水平发生变化，导致DNA复制与修复等基因的蛋白表达水平发生变化，增强了菌株在临近空间极端环境的耐受能力。UV435-94菌株代谢相关基因的突变引起蛋白合成等基因转录水平的增加，导致嘌呤合成等蛋白的表达水平发生变化，提高了突变株的肌苷产量。UV435-144菌株的细胞防御等基因的突变引起细胞膜信号转导等基因转录水平发生变化，导致DNA复制与修复等蛋白的表达水平发生变化，增加了突变株在临近空间极端环境的耐受能力。UV435-144菌株的蛋白合成相关基因的突变引起了核苷代谢相关基因的转录水平发生变化，提高了嘌呤和嘧啶合成途径关键蛋白的表达水平，导致UV435-144菌株的肌苷产量明显下降。<br>　　本论文将地表微生物搭载浮空飞行器进入我国内蒙古临近空间极端环境进行暴露实验，从多种突变菌株中成功分离出耐辐射的枯草芽孢杆菌肌苷工程菌，微孔板和摇瓶发酵获得肌苷产量明显变化的突变株。基因组-转录组-蛋白组联合分析发现突变株的磷酸化系统的转录与蛋白表达水平发生变化，引起糖酵解途径、磷酸戊糖途径、嘌呤核苷代谢途径和嘧啶核苷代谢途径的关键蛋白表达水平发生了改变，从而影响了突变菌株肌苷的生物合成水平。进一步分析发现突变菌株均发生了DNA复制与修复相关基因的转录水平和蛋白表达水平明显上调，使得细胞能够高效地对DNA损伤进行修复，提高了菌株对临空极端环境的耐受能力。本研究初步阐明了枯草芽孢杆菌肌苷工程菌在临近空间极端环境的分子进化机理，为探究地表微生物在临近空间极端环境条件下的适应机制和实现核苷的高效合成提供了理论基础。