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摘要产甲烷古菌贡献了地球上几乎所有生物甲烷的产生，它们能利用的产甲烷底物仅有H2+CO2、乙酸盐以及甲基类化合物。其中甲醇产甲烷途径最短，由甲醇类钴啉蛋白(MtaC)、甲醇类钴啉蛋白甲基转移酶（MtaB）和辅酶M甲基转移酶(MtaA)协同将甲醇的甲基转移到甲基辅酶M上，后者再被还原成甲烷。他人的研究表明多拷贝的mtaCB通常受甲醇底物的调控表达，但尚未澄清是在转录或转录后水平实现调控。<br>　　本实验室前期从青藏高原若尔盖湿地分离到一株只利用甲基途径产甲烷的嗜冷甲烷叶菌（Methanolobus psychrophilus）R15，比较转录组发现mtaC2在8℃和18℃培养物中的转录无明显差异，但蛋白组分析发现MtaC2蛋白的丰度在8℃上调，暗示mtaC2的低温上调发生在转录后水平。本研究试图解析M.psychrophilus R15的mtaC1和mtaC2受底物和温度的调控机制。<br>　　本研究通过RT-qPCR发现，M.psychrophilus R15的mtaC1在甲醇培养物中上调表达，但mtaC2在甲醇培养物中低表达;Western blot表明两蛋白的表达也具有同样的趋势。通过在三种培养物中分别加入另一种产甲烷底物后证明，甲醇激活mtaC1但抑制mtaC2的表达。对甲醇的8℃和18℃培养物中两个基因的表达差异分析发现，mtaC1在两个温度下的表达相当，而mtaC2的转录在8℃比18℃高8倍，而8℃培养物中的MtaC2蛋白量比18℃的高13倍，暗示温度对mtaC2的调控发生在转录后水平。<br>　　通过差异RNA测序和5''单磷酸测序分别测定mtaC2的转录起始位点(transcription start site，TSS)和加工位点(processing site，PSS)，结果检测到mtaC2的5''UTR(5''untranslated region)的两个加工位点(PSS)。RNA二级结构预测发现加工去除了5''UTR的复杂结构，暴露出核糖体结合位点而促进核糖体进入。我们通过构建lacZ和mCherry报告基因及Western Blot验证了5''UTR加工的mtaC2转录本具有更高的翻译效率;同时RNA半衰期实验证明加工转录本的稳定性提高。dRNA-seq检测到8℃比18℃的培养物中的mtaC25''UTR的加工强度更高，Northern blot和RT-qPCR验证了8℃下mtaC2的加工转录本丰度比18℃更高。因此揭示了mtaC2在低温下上调表达及低温下甲醇产甲烷的分子基础。为验证细胞中存在加工mtaC25''UTR的核酸酶，我们分析了加工位点附近的序列，发现存在符合“uridine ruler-and-cut mechanism”的特征序列。我们合成了含有此特征序列的RNA片段，并在两端连接富含GC的核苷酸使之形成发夹结构。已知的M.psychrophilus R15的β-CASP和PIN家族的核酸酶均不切割合成的RNA。而其无细胞抽提物能够切割合成的RNA，且切割位点与推测一致，表明M.psychrophilus R15中未知的核酸酶行使5''UTR的加工功能。<br>　　综上所述，MtaC1是M.psychrophilus R15主要的甲醇产甲烷功能蛋白，受甲醇诱导表达;而MtaC2主要在低温下发挥功能，低温对mtaC2的诱导表达通过转录后调控实现。古菌采用多个同工酶在不同环境条件下发挥作用，展示了它们高度的环境适应能力。