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摘要睡眠问题困扰着现代社会的多数人群，但由于人们对睡眠-觉醒行为的调控机制理解不够充分而缺少有效的治疗手段。睡眠-觉醒行为的最基本特征是睡眠稳态，即睡眠和清醒的平衡。睡眠稳态受包括腺苷在内的多种因素的调控。其中，基底前脑(BF)是腺苷调控睡眠稳态的关键脑区，清醒时腺苷在该脑区的积累被认为是睡眠压力（困意）产生的原因之一，但基底前脑区域腺苷释放的神经机制仍未被充分理解。本篇论文对基底前脑不同类型的细胞活动（包括神经元和星形胶质细胞）与胞外腺苷释放及其介导的睡眠稳态的调控进行了系统性的研究。<br>　　为了克服传统的腺苷浓度测量方法（微透析）在时间分辨率上的不足，我们利用了合作者开发的新型腺苷荧光探针(GRABAdo)。首先，合作者在离体条件下验证了GRABAdo对胞外腺苷的检测兼具高特异性和高时间分辨率，并且探针的亮度与胞外腺苷浓度呈正相关。此后，通过测量癫痫模型小鼠海马区域胞外腺苷水平在癫痫过程中的变化，我们在体验证了通过GRABAdo实时检测胞外腺苷水平的有效性。我们发现在单次癫痫快终止时总是伴随着GRABAdo荧光亮度的大幅度增加，这与文献报导癫痫会引起腺苷大量释放从而通过激活腺苷的A1受体来终止癫痫是一致的。<br>　　在验证了GRABAdo的有效性之后，我们将GRABAdo用于检测基底前脑腺苷水平在睡眠-觉醒行为中的变化。得益于GRABAdo的高时间分辨率，我们发现了传统的微透析方法未能揭示的腺苷水平在睡眠时相转变时的快速变化，并进一步解析了基底前脑不同种类细胞活动调控腺苷水平快速变化的神经机制。领域内的前期研究提示，基底前脑的胆碱能神经元和星形胶质细胞可能是该区域腺苷的主要来源，因此我们先探究了这两种细胞在腺苷快速释放中的作用。<br>　　首先，我们分析了胆碱能神经元和星形胶质细胞的活动与腺苷快速释放的相关性。通过双侧光纤记录，我们在同一只小鼠的一侧基底前脑记录胆碱能神经元或星形胶质细胞中由GCaMP表征的钙信号，在另一侧的基底前脑记录由GRABAdo表征的腺苷信号。我们发现胆碱能神经元和星形胶质细胞的钙信号与胞外腺苷浓度之间存在非常好的相关性，并且这两种细胞的活动改变都提前于腺苷信号的改变。另外，此前研究表明星形胶质细胞可能通过释放ATP并在胞外降解为腺苷的途径参与胞外腺苷积累，因此，我们进一步探究了胞外ATP水平与胞外腺苷水平之间的相关性。我们采用了新型ATP荧光探针（GRABATP）来记录胞外ATP浓度，并同时记录GRABAdo信号与GRABATP信号进行比较。分析表明GRABATP与GRABAdo的亮度之间存在非常高的相关性，并且GRABATP亮度变化也总是提前于GRABAdo亮度变化。<br>　　此后，我们研究了这两种细胞的活动与胞外腺苷快速释放之间的因果关系。用光遗传的方法特异性激活胆碱能神经元，可以引起GRABAdo信号微小但显著的上升，说明乙酰胆碱能神经元的活动直接参与腺苷的释放但较微弱。令人意外的是，用光遗传学的方法增加星形胶质细胞的钙活动并不能引起GRABAdo亮度的增加。为了进一步明确星形胶质细胞是否在腺苷快速释放中起作用，我们检测了敲除将胞外ATP转化为腺苷的关键酶CD73的小鼠中的GRABATP和GRABAdo信号，发现敲除CD73不影响腺苷浓度的快速动态变化及ATP和腺苷浓度变化的相关性。这些结果表明星形胶质细胞不能介导睡眠觉醒周期中腺苷快速释放。<br>　　与前期研究结果不同，我们的数据显示基底前脑的胆碱能神经元和星形胶质细胞可能都不是腺苷的主要来源，因此我们进一步探究了基底前脑其他种类的神经元在腺苷快速释放中的作用。其中，谷氨酸能神经元在基底前脑睡眠觉醒调控网络中的促觉醒功能最为显著，此外，谷氨酸能神经元可以广泛激活基底前脑其他种类的神经元，而我们观察到的快速腺苷释放又与神经元活动高度相关。因此，我们猜测谷氨酸能神经元可能在调控腺苷快速释放中发挥重要作用。通过双光纤记录法，我们发现谷氨酸能神经元活动提前于胞外腺苷浓度变化，且两者之间存在非常好的相关性。值得注意的是激活谷氨酸能神经元可以引起胞外腺苷浓度的大幅度上升，更重要的是采用caspase特异性损毁该类细胞显著减弱了睡眠-觉醒周期中腺苷的快速变化。这些结果表明基底前脑的谷氨酸能神经元是睡眠觉醒周期中该区域腺苷快速释放的主要原因。<br>　　考虑到基底前脑的腺苷对于睡眠稳态的重要调控作用，我们进一步探究了不同种类的细胞对睡眠稳态的调控作用。采用caspase特异性损毁胆碱能神经元对小鼠的睡眠稳态几乎没有影响，而损毁谷氨酸能神经元则显著改变小鼠的睡眠稳态。损毁谷氨酸能神经元后，小鼠在夜间的清醒时长大幅提升，睡眠剥夺引起的恢复期睡眠时长的增加量缩短，对睡眠压力指针慢波活动(SWA)的清除明显加速，表明小鼠的睡眠压力显著减小。因无法用caspase损毁星形胶质细胞，我们在星形胶质细胞上表达了一种钙泵(hPMCA2w/b)，持续性地将胞内的钙泵到胞外，从而降低星形胶质细胞的活动。我们发现降低基底前脑区域星形胶质细胞活动也引起了小鼠的睡眠稳态变化，主要表现为夜间清醒时间显著增加，但是对睡眠剥夺后的恢复期睡眠时长的影响较小。这说明基底前脑的星形胶质细胞也参与睡眠稳态调控，但可能不是基于影响腺苷释放的机制。<br>　　综上所述，本论文通过使用新型腺苷荧光探针和转基因动物，结合光纤记录、光遗传学操控和特异性损毁等方法系统性地探究了基底前脑区域不同类型细胞活动对睡眠稳态调控的贡献，揭示了睡眠-觉醒周期中基底前脑区域腺苷快速释放的神经机制，为开发睡眠觉醒调控技术提供了重要的理论支持。