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摘要急性肺损伤(ALI)以细胞因子的释放和中性粒细胞积累为主要特征，严重时会发展为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，平均死亡率高达40％（各年龄段患者死亡率有差异）。近20年来医疗条件的改善极大的增加了ALI/ARDS患者的生存时间。但有关药物治疗的现状却始终不尽如人意。目前，还没有结论性的证据证明有药物能够降低ARDS患者的死亡率。炎症在ALI中发挥着重要的作用，ALI的病理机制与过度炎症密切相关。因此，有效控制炎症是缓解ALI的潜在途径。文献调研显示浙贝母和连翘都具有抗炎的作用，且浙贝母和连翘联合可作为一个药对治疗各种炎症性疾病，但具体的作用机制未见报道。浙贝母和连翘联合之所以能够作为一个药对使用可能与其中所含成分间的相互作用相关。贝母素甲(P1)、贝母素乙(P2)为浙贝母中的活性指标成分，连翘脂苷A(FA)为连翘中的活性指标性成分，且都具有抗炎或抗ALI的作用。因此这些单体成分联合可能发挥更好的抗炎作用。近年来，作为治疗炎症和其他疾病的更有效方法，单体化合物联合使用被广泛研究，且多项研究证实药物联合后发挥了更好的抗炎作用。因此本研究假设P1、P2和FA联合使用具有协同抗炎、抗ALI作用，并以此展开研究。若假设成立，这将为浙贝母和连翘作为一个药对治疗炎症性疾病提供一定的理论依据，也为P1、P2和FA联合使用作为抗ALI药物提供合理的支持。<br>　　目的:<br>　　本研究以上述背景为基础对P1、P2和FA联合抗ALI的作用及其机制进行探究，旨在为浙贝母和连翘联合治疗炎症性疾病提供一定的理论依据，也为P1、P2和FA联合治疗ALI提供合理的支持。<br>　　方法:<br>　　本研究首先运用网络药理学的方法对P1、P2和FA联合治疗ALI的可能性及其作用机制进行预测。利用PubChem、SwissTargetPrediction、SEA、DrugBank、TargetNet数据库收集筛选P1、P2和FA相关靶标，利用DisGeNET、GeneCards、Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM)、Therapeutic Target Database(TTD)数据库收集筛选ALI相关靶标。利用FunRich软件绘制P1、P2和FA靶标与ALI靶标韦恩图，得到交集靶标。将交集靶标输入String网站进行蛋白互作(PPI)网络分析，然后再将结果导入Cytoscape数据库利用Network Analyzer功能进行分析，筛选得到P1、P2和FA联合治疗ALI的重要靶标。利用分子对接技术对主要靶标进行了验证。利用Metascape数据库进行GO通路及生物功能分析，富集到P1、P2和FA联合治疗ALI的主要信号通路以及生物学过程，进一步分析了KEGG信号通路，并对排名前20的信号通路进行了可视化处理。<br>　　其次在网络药理学结果的指导下，以脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）诱导的RAW264.7巨噬细胞损伤及小鼠ALI为模型进行体内外验证。体外验证:MTT法检测不同浓度P1、P2和FA(6.25-100μM)对细胞的毒性作用。在无毒剂量下(50μM)，运用Griess和ELISA法测定了P1、P2和FA单独或联合对LPS诱导细胞上清中NO、IL-6和TNF-α含量的影响。采用斑马鱼实验进一步评估P1、P2和FA单独或联合对斑马鱼毒性。随后运用RT-PCR，免疫荧光染色，Western blotting等技术手段对网络药理学预测到的信号通路进行逐一验证。体内验证:采用口咽吸入给予小鼠LPS（5mg/kg），在给药后的不同时间点(0、2、6、12和24h)取材，检测肺组织病理(HE染色)、肺湿干重比(warm/dry(W/D))、BALF中总蛋白浓度、总细胞数、NO、IL-6、TNF-α和MPO含量。通过这些指标的变化评估各组小鼠肺组织的损伤情况，选择出ALI的最佳诱导时间，建立小鼠ALI模型。然后通过检测P1、P2和FA联合对LPS诱导小鼠肺损伤各项指标变化的影响，评估P1、P2和FA联合的抗ALI作用。并运用RT-PCR、免疫组化染色和Western blotting技术评估P1、P2和FA联合抗ALI的主要机制。<br>　　结果:<br>　　利用网络药理学收集到了P1、P2和FA不重复靶标与ALI的交集靶标共计107个，其中有14个靶标是P1、P2和FA的共有靶标，包括IL-6、GBA、GAA、CXCL8、CCR3、ALOX5、AKT1、HMOX1、ACE、CD40LG、TNF-α、PTGS2、PARP1、MMP9。在Cytoscape3.6.0中，利用Network Analyzer功能筛选度值排名前20位的靶点为STAT3、TNF-α、IL-6、AKT1、EGFR、MAPK3、JUN、TLR4、SRC、IL-10、CD4、INS、CASP3、ALB、CXCL8、MAPK8、MAPK1、PIK3CA和IL-4。其中TNF-α、IL-6和AKT1既是筛选出的排名靠前靶标，也属于P1，P2和FA的共有靶标，被认为是P1，P2和FA联合治疗ALI的重要靶标。分子对接结果显示，TNF-α、IL-6和AKT1理论上都能与P1、P2和FA对接，但结合力有所不同，单从结合力上判断，P1与IL-6结合能力较强;P2与TNF-α结合能力较强，FA与AKT1结合能力较强。其中FA与以上靶点结合时氢键数都比较多，FA在它们的联合使用中可能发挥着重要的作用。对药物与疾病交集靶标进行GO生物功能和通路分析得到了相应的生物学过程和通路。在20个可视化的KEGG信号通路中，与肺部炎症最为相关的信号通路为IL-17、TLR4、NLRP3和PI3K-AKT信号通路。本研究认为这些信号通路是P1、P2和FA联合治疗ALI的重要信号通路。<br>　　体外实验结果显示，在相同浓度下，P1、P2和FA联合对细胞和斑马鱼的毒性低于单独使用FA(p＜0.05)，P1、P2联合FA能更有效地减少细胞上清中NO、IL-6和TNF-α含量(p＜0.05)，并抑制细胞中IL-6和TNF-αmRNA表达(p＜0.05)，并且更显著的抑制LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中IL-6、TNF-α、IL-1β和iNOS(p＜0.05)蛋白的表达。可见联合用药具有减毒和更好的抗炎作用。为了进一步验证P1、P2和FA联合的体外抗炎机制，采用Western blotting对网络药理学预测的信号通路进行检测。结果发现LPS诱导RAW264.7巨噬细胞后，TLR4及相关下游信号通路、NLRP3炎症小体和PI3K/AKT信号通路被激活，相关蛋白表达升高(p＜0.05)，P1、P2和FA单独或联合均能不同程度的抑制这些蛋白的表达，且药物联合使用抑制作用更加明显(p＜0.05)。<br>　　体内实验结果显示，LPS以5mg/kg的剂量给予小鼠，在诱导后的0、2、6、12和24h时检测各项指标变化情况。HE染色结果显示，6h和12h时病理损伤更为严重;BALF的检测结果显示，6h和12h时，总蛋白浓度、总细胞数、IL-6、TNF-α、NO和MPO含量与0h相比均变化显著(p＜0.05)。肺组织检测结果显示，6h和12h肺组织IL-6和TNF-α蛋白水平与0h相比均变化显著(p＜0.05)。鉴于6h时间更短，所以最终本实验选择了6h作为最佳造模时间。P1、P2和FA单独或联合给予小鼠1h后，LPS诱导6h后检测各项指标变化。结果显示，P1、P2和FA联合更加有效的改善了小鼠肺组织病理状况、肺水肿程度，抑制了BALF中总细胞数、NO、IL-6、TNF-α及MPO含量的增加。与细胞实验结果一致，P1、P2和FA联合更加显著的抑制了TLR4、NF-κB、MAPK、NLRP3和PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达(p＜0.05)。另外，LPS给予小鼠后导致小鼠血清中IL-17含量明显升高(p＜0.05)，肺组织中IL-17、IL-17RC和ACT1蛋白表达升高(p＜0.05)，P1、P2和FA联合与单独使用相比更加显著抑制了它们的升高(p＜0.05)。<br>　　结论:<br>　　1.通过网络药理学方法预测P1、P2和FA联合抗ALI具有一定的合理性。其中TNF-α、IL-6和AKT1为P1、P2和FA联合抗ALI的主要作用靶点，IL-17、TLR4、NLRP3和PI3K-AKT信号通路为P1、P2和FA联合抗ALI的主要信号通路。分子对接验证了其主要靶点预测的合理性。这些结果预示着P1、P2和FA联合可能通过多通路、多靶点发挥抗ALI的作用。2.在LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞损伤模型中，P1、P2和FA联合具有协同抗炎作用，且主要经由TLR4介导的NF-κB/MAPK信号通路，PI3K/AKT介导的NF-κB信号通路，以及NLRP3信号通路发挥抗炎作用，改善细胞损伤。3.在LPS诱导的小鼠ALI模型中，P1、P2和FA联合具有协同抗炎作用，且主要经由IL-17/TLR4介导的NF-κB/MAPK信号通路，PI3K/AKT介导的NF-κB信号通路，以及NLRP3信号通路发挥抗炎作用，改善小鼠ALI。