脂肪来源干细胞及其条件培养基在防治血管内皮细胞氧化应激和皮瓣缺血再灌注中的研究-论文-万方医学网

脂肪来源干细胞及其条件培养基在防治血管内皮细胞氧化应激和皮瓣缺血再灌注中的研究

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摘要研究背景： 　　皮瓣移植是整形外科中最为重要，也是应用最为广泛的修复重建方法。然而，影响皮瓣存活的主要原因之一是皮瓣缺血再灌注损伤，尤其在带蒂皮瓣或游离皮瓣移植中。在缺血再灌注过程中，皮瓣组织受到氧化应激、炎性损伤和细胞凋亡等多种病理损伤。针对这些病理机制，学者们尝试了多种方法。其中，脂肪来源干细胞（adipose derived stem cells，ADSCs）具有多向分化潜能和旁分泌信号传导作用，已被证实具有防治皮瓣缺血再灌注损伤的确切效果。 　　目前多数研究主要建立在单一剂量ADSCs在短时间缺血的再灌注皮瓣中的作用。影响缺血再灌注损伤的最首要的因素是缺血的时间，但是皮瓣缺血再灌注损伤与ADSCs治疗效果的剂量依赖性和皮瓣缺血时间的条件限制性相关的研究仍较少。此外，在皮瓣缺血再灌注过程中，血管内皮细胞遭受的氧化应激损伤直接导致微循环障碍，加重皮瓣损伤。对此，ADSCs被证实在多种缺血再灌注器官或组织中具有抗氧化应激的作用。ADSCs是否可以保护血管内皮细胞免受氧化应激损伤，目前尚无研究。 　　随着皮瓣缺血时间的增长，缺血再灌注损伤的程度加重。在皮瓣移植后出现的血液循环障碍称为继发性缺血，往往由于血栓阻塞、血管蒂扭转等原因导致，造成的损伤更大。尽早发现血运障碍并实施再通手术是将缺血时间降至最低的最有效的方法。对此，学者们提出了多种监测皮瓣血运的方法，其中通过检测皮瓣血糖的降低来诊断皮瓣血运障碍的方法被证明经济且实用。但是，对于糖代谢障碍的糖尿病模型是否可以应用该方法，目前尚无实验研究。 　　研究目的 　　1.探究在体外细胞氧化应激模型中，ADSC的条件培养基(ADSC-CM)对人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）氧化应激损伤是否有保护作用以及进一步探究可能的分子机制。 　　2.通过建立不同缺血时间下缺血再灌注皮瓣模型，探究ADSCs在不同皮瓣缺血时间和不同治疗剂量的条件下，对皮瓣缺血再灌注治疗效果的影响。 　　3.在糖尿病大鼠静脉淤血皮瓣模型中，验证通过使用连续间质葡萄糖监测仪检测皮瓣葡萄糖的水平变化来评估糖尿病皮瓣血运障碍的有效性。 　　研究方法 　　1.脂肪来源干细胞条件培养基在防治血管内皮细胞氧化应激损伤中的研究 　　(1)使用Ⅰ型胶原酶从人脂肪组织中获得ADSCs，诱导成脂、成骨、成软骨三系分化，做细胞表面标志物流式分析。取细胞上清，制备ADSC-CM。 　　(2)建立H2O2诱导的HUVEC细胞氧化应激损伤模型，确定半数致死剂量。 　　(3)采用50％ADSC-CM和100％ADSC-CM预培养HUVEC，同时以ECM基础培养基作为对照。600μMH2O2处理4h后，采用CCK-8法检测各组细胞存活率。 　　(4)采用DCFH-DA探针法标记细胞活性氧，流式分析定量检测活性氧水平;采用检测试剂盒检测氧化应激产物MDA和抗氧化酶(CAT、SOD、GSH-Px)活性;采用Annexin V法检测凋亡细胞。 　　(5)采用RT-qPCR技术检测HUVEC中mRNA水平变化，包括Keap1、Nrf2、CAT、SOD、GSH-Px、NQO1等氧化应激相关，Bax、Bcl-2、Caspase-3凋亡相关和IL-6、IL-8等炎症相关基因。 　　2.脂肪来源干细胞在防治皮瓣缺血再灌注损伤中的研究 　　(1)使用Ⅰ型胶原酶从大鼠腹股沟脂肪垫中提取ADSCs并培养增殖，选择P3代及以内的细胞用于皮瓣内注射。 　　(2)建立大鼠缺血再灌注腹部皮瓣模型，将67只SD大鼠按夹闭血管时间随机分为Sham组、3h缺血组、6h缺血组和9h缺血组，每个缺血组再按ADSCs注射细胞量分为低剂量组(5×106cells)和高剂量组(1×107cells)。在术后第5天观察皮瓣存活情况并拍照记录。 　　(3)术后第5日，使用激光多普勒仪测量皮瓣血流灌注;取皮瓣全层组织进行组织学染色并做病理评分;CD31免疫组化染色观察皮瓣组织内血管密度;TUNEL染色检测组织细胞凋亡程度;透射电镜观察皮瓣超微结构的变化。 　　3.连续葡萄糖监测在糖尿病静脉淤血皮瓣监测中的研究 　　(1)将41只SD大鼠随机分为对照组、糖尿病组和胰岛素组。采用链脲佐菌素（STZ;50mg/kg）一次性腹腔注射诱导糖尿病大鼠模型。糖尿病大鼠模型造模成功后，每天两次皮下注射2～4U/kg胰岛素，使血糖控制在正常水平，即为胰岛素组。 　　(2)建立以腹壁上血管为蒂的双侧腹直肌肌皮瓣模型，在两侧肌皮瓣上各安装一个连续间质葡萄糖监测传感器。结扎一侧腹壁上静脉制备静脉淤血的结扎皮瓣，对侧皮瓣不做处理作对照皮瓣。 　　(3)从结扎开始，每5min测量一次双侧皮瓣的间质葡萄糖值，直至数值降至测量值下限或停止下降并趋于稳定。同时，每15min测量一次尾静脉血糖。 　　研究结果 　　1.脂肪来源干细胞条件培养基在防治血管内皮细胞氧化应激损伤中的研究 　　(1)研究培养的ADSCs具备向成脂、成骨、成软骨分化的能力，表面标志物CD73、CD90和CD105表达阳性，CD19、CD34、CD45和CD11b表达阴性，符合间充质干细胞特征。 　　(2)50％ADSC-CM和100％ADSC-CM预培养后的HUVEC在暴露于600μM H2O24h后存活率明显提高，且ADSC-CM浓度越高存活率越高。 　　(3)在ADSC-CM组中，HUVEC细胞内活性氧的生成降低，抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px活性提高，氧化应激产物MDA生成降低。同时，ADSC-CM组中HUVEC的细胞凋亡率明显降低。 　　(4)RT-qPCR结果显示在ADSC-CM组中，参与抗氧化调控通路的基因Keap1和Nrf2表达上调，抗氧化酶基因CAT、SOD2和GSH-Px的表达上调。同时，促凋亡基因Bax和Caspase-3的水平被下调，抗凋亡基因Bcl-2上调，炎症因子IL-6和IL-8的表达下调。 　　2.脂肪来源干细胞在防治皮瓣缺血再灌注损伤中的研究 　　(1)随着缺血时间的延长，腹部皮瓣存活率明显下降。3h、6h和9h缺血组的皮瓣存活率分别为68.1±9.7、43.6±6.2％和24.6±-6.8％。在6h和9h缺血条件下，应用低或高剂量ADSCs均可以提高皮瓣存活率，在6h缺血时呈剂量依赖性。 　　(2)多普勒血流灌注结果显示应用ADSCs在三个缺血时间条件均可以提高皮瓣血流灌注量。CD31免疫组化结果显示在6h和9h缺血条件下，ADSCs可以提高皮肤内血管密度。 　　(3)组织学染色显示缺血再灌注损伤使皮瓣出现表皮层缺损，炎性细胞浸润和毛囊破坏等损伤。在6h和9h缺血条件下，ADSCs可以提高病理评分，改善组织损伤。当9h缺血时，ADSCs可以降低组织细胞凋亡程度。 　　(4)透射电镜发现ADSCs可以减轻内皮细胞损伤，维持血管完整性，减少细胞间水肿。 　　3.连续葡萄糖监测在糖尿病静脉淤血皮瓣监测中的研究 　　(1)所有皮瓣在静脉结扎后，间质葡萄糖以不同趋势降低到最低水平。糖尿病组从静脉结扎到最低间质血糖水平的时间明显长于对照组（120.8±5.7min vs.56.5±6.7min），而胰岛素组和对照组的时间相似(56.5±6.7min vs.56.0±6.6min)。 　　(2)对照组皮瓣间质葡萄糖以稳定的速度下降，持续时间56.5±6.7min。糖尿病组皮瓣间质葡萄糖的下降始于一段持续49.0±6.4min的平台期，然后缓慢下降49.0±6.4min至最低水平。胰岛素组皮瓣间质葡萄糖的变化均始于一段持续24.4±4.3min的缓慢下降期，然后在34.3±5.7min内快速下降至最低水平。 　　研究结论 　　1.在体外，ADSC-CM预培养可以通过增强抗氧化酶活性和抑制细胞凋亡对H2O2诱导的HUVEC细胞氧化应激损伤起到保护作用，作用机制可能与激活参与抗氧化系统的Keap1-Nrf2-ARE信号通路或者抑制炎症反应有关。 　　2.ADSCs可以通过促进血管再生、减轻炎症反应、抑制凋亡的作用，减轻缺血再灌注对皮瓣的损伤。对于中、长时间缺血导致的皮瓣严重损伤，ADSCs具有显著保护作用并存在剂量依赖性。 　　3.通过使用连续间质葡萄糖监测仪检测皮瓣间质葡萄糖的变化，来评估糖尿病皮瓣移植后的静脉闭塞是具有可行性的。但是，糖代谢功能的损伤显著延长了静脉闭塞后间质葡萄糖下降的速度，也延长了发现时间。使用胰岛素控制血糖可以恢复间质葡萄糖下降的时间，但初期仍反应缓慢，需要提高警惕。