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摘要本文从三部分进行阐述：<br>　　第一部分肌萎缩侧索硬化的DNA甲基化特征<br>　　目的:<br>　　本研究旨在通过比较散发性肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)患者和健康对照(health control，HC)全血样本的DNA甲基化特征，探索DNA甲基化在ALS发病中的作用。<br>　　方法:<br>　　共纳入2020年12月至2021年5月期间在本院神经科门诊就诊的临床确诊、临床拟诊、实验室支持-临床拟诊的散发性ALS患者32例作为病例组，选择同时期陪同患者就诊的健康家属作为对照组。采集两组的人口学资料和临床资料。记录患者的诊断级别、起病年龄、起病部位、病程、ALSFRS-R(Revised ALS Functional Rating Scale)评分、King分期和反映早期疾病进展的△ALSFRS-R。采集外周全血，提取样本中的基因组DNA后，进行亚硫酸盐转化和NaOH变性，对基因组DNA进行片段化和用随机内切酶酶切扩增产物，最后与Infinium MethylationEPICBeadChip芯片杂交、单碱基延伸及染色。芯片扫描读取数据后进行相关的生物信息学分析。<br>　　结果:<br>　　与HC组相比，ALS组存在34个差异甲基化位点(differentially methylated position，DMP)，其中5个DMP呈现高甲基化，29个DMP呈现低甲基化。这些DMP注释到13个基因，其中高甲基化的基因2个，分别是ATAD3B和BLK;低甲基化的基因11个，分别是DDO、IQCE、ABCB1、DNAH9、FIGN、NRP1、TMEM87B、CCSAP、ST6GALNA C5、MYOM2和RUSC1-AS1。与HC组相比，ALS组存在12个差异甲基化区域（differentially methylated region，DMR），注释到12个基因，分别是NWD1、LDHD、C1S、IQCE、TNF、PDE1C、LGALS1、CSNK1E、LRRC23、ENO2、ELOVL2和ELOVL2-AS1。根据Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes数据库的信息，DNAH9和TNF参与了ALS的通路。相关性分析发现ELO VL2的甲基化水平和起病年龄呈显著正相关（r=0.86，adjust P=0.001），ARID1B的甲基化水平和病程呈显著正相关(r=0.83，adjust P=0.01)。但是，并没有发现任何甲基化位点和ALSFRS-R评分或者ΔALSFRS-R显著相关。ALS组的整体甲基化水平和HC组无显著差异(P＞0.05)。<br>　　结论:<br>　　本研究发现了与ALS相关的DMP基因和DMR基因，提示诸如DNAH9和TNF的低甲基化等表观遗传学改变在ALS的病因中起到了重要作用，为从表观遗传学角度揭示ALS的发病机制提供了新的线索。未来的研究应着重关注这些DMP基因和DMR基因，并在更大样本量的队列中进行验证，为寻找新的治疗靶点奠定基础。<br>　　第二部分肌萎缩侧索硬化的转录组特征和DNA甲基化的关联<br>　　目的:<br>　　本研究通过转录组测序对第一部分研究中的肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)患者和健康对照(heathy control，HC)外周血mRNA表达水平进行测定，旨在寻找两组间差异表达的基因和相应的功能。结合前期DNA甲基化研究的结果，寻找差异表达基因(differentially expressed gene，DEG)和差异甲基化基因（differentially methylated gene，DMG）之间的联系，为验证候选基因奠定基础。<br>　　方法:<br>　　研究对象是第一部分研究中的12例ALS患者和12例HC。使用PAXgene Blood RNA Tube采血管收集研究对象的外周血，提取总RNA后进行建库测序。在完成数据质控后，将clean reads与人的参考基因组比对，对基因表达水平进行定量，以FoldChange大于1.2，P值小于0.05为筛选标准进行差异分析，对差异基因进行富集分析和基因集的富集分析。对本研究中的DEG和第一部分研究中的DMG取交集，并利用实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)对交集基因的表达水平进行验证。<br>　　结果:<br>　　与HC组相比，在ALS患者外周血中筛选到DEG1001个，其中表达上调的基因629个，表达下调的基因372个。这些基因富集于多条可能与ALS相关的通路，其中氧化应激的通路、核糖体和线粒体两个细胞器相关的通路值得关注。DEG和DMG的交集基因分别为LGALS1、TNF、LDHD和RUSC1-AS1。qRT-PCR证实ALS患者外周血LGALS1mRNA表达水平较HC组明显升高。<br>　　结论:<br>　　转录组测序结果揭示了ALS患者外周血的转录组特征和DNA甲基化的关联。DEG和DMG的交集基因LGALS1可能是值得进一步深入研究的候选基因。<br>　　第三部分LGALS1基因启动子区甲基化与肌萎缩侧索硬化的相关性研究<br>　　目的:<br>　　本研究通过对肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）患者和健康对照(healthy control，HC)外周血中LGALS1基因启动子区的甲基化水平进行测定，旨在寻找该基因DNA甲基化和ALS的相关性。同时，对LGALS1编码的蛋白galectin-1在外周血中的表达含量进行检测，比较两组间的差异，并探索LGALS1基因启动子区甲基化对外周血galectin-1表达的影响。<br>　　方法:<br>　　本研究纳入45例ALS患者和32例HC，入组时留取外周血样本。利用亚硫酸盐处理后测序(bisulfite sequencing PCR，BSP)对LGALS1基因启动子区1个CpG岛中的12个CpG位点进行检测，主要流程包括基因组DNA的提取、亚硫酸盐转化、TA克隆和测序，用甲基化率表示每个CpG位点的甲基化水平。同时，通过酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测外周血galectin-1的含量。比较ALS组和HC组之间CpG位点甲基化水平的差异，并分析每个CpG位点甲基化水平与ALS患者临床特征的相关性。同时，比较ALS组和HC组外周血galectin-1表达水平的差异，并分析LGALS1基因启动子区甲基化水平和外周血galectin-1表达水平的相关性。<br>　　结果:<br>　　在LGALS1基因启动子区的CpG岛中，CpG1、CpG3、CpG4、CpG5、CpG7、CpG8、CpG9、CpG11和CpG12位点的甲基化水平在ALS组显著低于HC组，差异有统计学意义(P＜0.001;P＜0.001;P=0.001;P=0.004;P＜0.001;P＜0.001;P＜0.001;P＜0.001;P＜0.001)。ALS组12个CpG位点总体甲基化水平显著低于HC组，差异有统计学意义(P＜0.001)。ALS组外周血galectin-1水平显著高于HC组，差异有统计学意义(P=0.007)。在ALS组和HC组，LGALS1基因启动子区总体甲基化水平与galectin-1表达水平呈负相关（r=-0.571，P＜0.001）。与起病年龄≤45岁的ALS患者相比，起病年龄＞45岁的ALS患者在CpC3、CpG4、CpG7和CpG11位点的甲基化水平以及12个CpG位点的总体甲基化水平均显著降低(P=0.006;P=0.041;P=0.003;P=0.013;P＜0.001)。CpG1、CpG7、CpG11和CpG12位点的甲基化水平及12个CpG位点的总体甲基化水平均与起病年龄显著负相关(P=0.020;P＜0.001;P=0.025;P=0.044;P=0.001)。<br>　　结论:<br>　　LGALS1基因启动子区在ALS中呈低甲基化，其编码的蛋白galectin-1在ALS患者外周血中高表达，且其甲基化水平与疾病的起病年龄呈负相关。本研究揭示了LGALS1基因启动子区甲基化和ALS的相关性，为未来进行深入的机制研究奠定了基础。