检索历史 清除

摘要甲型流感病毒(InfluenzaA virus)感染会引发高度传染性的急性呼吸道疾病，严重威胁人类公共卫生安全。甲型流感病毒的基因组包含八个分节段的单股负链RNA(vRNA)，每个RNA片段由中间的编码区与两端的非编码区(noncoding region，NCR)构成。NCR在八个病毒基因片段中表现出片段特异性，被称为片段特异性NCR。另外，NCRs在决定不同亚型的HA和NA基因片段中又表现出亚型特异性，因此HA和NA的NCR又被称为亚型特异性NCR(ssNCR)。流感病毒的八个基因组片段在细胞核中以病毒核糖核蛋白复合物(vRNP)的形式进行复制，然后运输到质膜并选择性包装进入子代病毒粒子。病毒基因组RNA作为一个重要的调控中心，可以形成复杂的二级结构协调病毒和宿主分子来完成这些功能。因此研究病毒基因组RNA的序列以及结构如何参与这些调控过程，将加深对病毒生命周期精细调控的理解。<br>　　为了深入了解流感病毒RNA结构对病毒复制的影响，通过ieSHAPE和PARIS技术，首次绘制了细胞内甲型流感病毒A/WSN/33(H1N1)的RNA二级结构图谱以及RNA-RNA相互作用网络。通过比较病毒基因组RNA在细胞内和病毒粒子内的icSHAPE数据，发现病毒RNA在细胞中更容易呈现单链状态，这是由于病毒RNA与细胞中的蛋白结合所导致的。另外，在细胞内和病毒粒子内都发现了大量的RNA-RNA相互作用，但是相互作用图谱显示在两种环境之间病毒基因组RNA相互作用存在较大差异。病毒粒子内形成的主要是片段间相互作用，占总相互作用的74％;而细胞内形成的片段间相互作用很少，只占总相互作用的5％。此外，发现了一个稳定存在于细胞内和病毒粒子内的PA片段内的远程相互作用结构，深入的功能分析揭示了该结构在病毒粒子的包装中发挥作用。更重要的是，我们的动物实验进一步证实了该结构对病毒致病性的重要性。这项工作为甲型流感病毒基因组的RNA结构以及vRNP包装过程提供了重要的见解，并且为设计靶向RNA结构的抗流感病毒寡核苷酸药物提供了平台。<br>　　另外，为了深入了解流感病毒H1-ssNCRs的序列特征对病毒复制的影响，设计了病毒随机核苷酸选择试验(vRNSA)。将3''和5''H1-ssNCRs分别为三组，在每组对应位置引入随机突变，通过反向遗传系统拯救病毒，通过在MDCK细胞上连续传代，含有病毒复制效率更高的ssNCR序列的重组病毒在连续传代过程中占据优势。结果表明，在连续传代过程中，H1-ssNCR的3''端序列比5''端序列稳定得更快。此外，高度保守的3''和5''启动子区域附近的核苷酸对序列稳定性的要求更高。对于距离启动子较远的核苷酸，它们对A和U碱基比例的要求高于对原始序列的要求。此外，发现3''A19U点突变严重破坏了HA vRNA的转录和复制，从而减弱了病毒的毒性。在连续传代后，出现邻近的3''U23G突变，恢复了HA RNAs水平和病毒滴度，表明这些核苷酸之间存在功能协调。这些结果首次揭示了3''和5''H1-ssNCRs之间以及3''和5''H1-ssNCRs不同位置核苷酸的序列要求差异对病毒繁殖的调控作用。