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摘要研究背景:<br>　　扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是导致心力衰竭和死亡的主要因素之一，其中，遗传性DCM占30-48％。多种基因突变位点均可导致遗传性DCM，为了寻找新的DCM突变位点，本课题组前期在接受心脏移植的终末期扩心病患者中发现β-sarcoglycan(SGCB，rs146888744)位点纯合突变与扩心病高度相关，携带突变的患者占比高达6.6％，且此位点为东亚人群特有突变位点。SGCB蛋白是sarcoglycan复合物（sarcoglycan complex，SGC）中的一个成员，SGC与其他相关蛋白构成dystrophin-糖蛋白复合物（dystrophin glycoprotein complex，DGC）。SGCB为细胞骨架蛋白，主要表达在骨骼肌和心肌等肌细胞中，维持细胞结构和功能的稳定，缺陷可导致相关心肌病。为阐明SGCB(rs146888744)点突变与心肌病关系以及致病机制，本研究构建了SGCB(rs146888744)点突变小鼠进行研究。<br>　　研究方法和结果:<br>　　(1)成功构建SGCB(rs146888744)点突变小鼠<br>　　利用CRISPR/Cas9技术，构建了SGCB(rs146888744)杂合突变(heterozygous，Het)鼠以及纯合突变（homozygous，Hom）鼠。同时，引进了SGCB敲除(knockout，KO)鼠，繁育得到纯合鼠作为SGCB基因缺失的阳性对照鼠。<br>　　(2)SGCB(rs146888744)点突变纯合小鼠SGCB表达缺失，继发DGC相关蛋白表达量下降<br>　　心肌组织western blot(WB)检测结果显示，Het鼠SGCB表达量与WT鼠一致，而Hom鼠和KO鼠心肌无SGCB表达。免疫荧光染色结果显示SGCB表达于WT鼠和Het小鼠心肌细胞膜。此外，WB结果显示，Hom鼠和KO鼠心肌中SGCA、SGCG、SGCD、SGCE、SGCZ、sarcospan、dystroglycan-α以及dystrophin都有不同程度的表达下降。<br>　　(3)SGCB(rs146888744)点突变对小鼠心脏结构和功能的影响<br>　　对出生后14天和2月龄WT鼠、Het鼠、Hom鼠和KO鼠4种小鼠进行研究。心脏超声结果显示，14天时，4种小鼠心脏收缩期左室后壁(left ventricular posterior wall，LVPW)、室间隔（interventricular septum，IVS）、左室内径(left ventricular internal diameter，LVID)和射血分数（ejection fraction，EF）值无明显变化。苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色提示，4种小鼠在细胞形态学层面也无显著区别，提示SGCB缺陷小鼠心脏早期未发生病变。2月龄时，心脏超声结果显示Hom鼠与KO鼠心脏收缩期LVPW和IVS较WT鼠明显增厚，左室收缩期LVID减小，EF值也显著增高，Het鼠较WT鼠无明显差异。Hom鼠和KO鼠心重体重比较WT鼠增加。活检结果显示，Hom鼠和KO鼠左室肌小梁较WT鼠更密集、排列紊乱。HE染色提示Hom小鼠和KO鼠心肌相比WT鼠有少量炎细胞浸润，且出现明显坏死。Masson染色提示Hom鼠和KO鼠心肌纤维化面积较WT鼠明显增加。<br>　　(4)SGCB(rs146888744)点突变对小鼠生理功能的影响<br>　　为探究2月龄Hom鼠生理功能变化，监测了2月龄时4种小鼠的心率、血压以及心电图，Het鼠与WT鼠结果一致。Hom鼠和KO鼠的静息心率低于WT鼠。Hom鼠和KO鼠的动脉收缩压较WT鼠有下降。心电图显示Hom鼠及KO鼠R波较WT鼠高。跑步实验显示，Hom鼠和KO鼠跑步时间和距离较WT鼠明显缩短，提示运动能力下降。<br>　　(5)SGCB(rs146888744)点突变致病机制探究<br>　　对出生后1天、7天、14天、21天及60天KO小鼠和WT鼠心肌进行了RNA测序。其中，出生14天KO鼠和WT鼠基因表达差异最明显。RNA测序结果显示，LRRC66表达上调和TIMP4表达下调显著，与qRT-PCR验证结果一致。蛋白层面，LRRC66在Hom鼠和KO鼠心肌中表达较WT鼠无明显变化。因TIMP4可抑制基质金属蛋白酶（matrix metalloprotease，MMP）活性，所以首先在RNA测序结果中筛出差异MMPs并进行qRT-PCR验证，结果提示MMP2表达上调。M MP活性检测结果显示Hom鼠和KO鼠心肌MMP2活性较WT鼠高。<br>　　(6)多西环素治疗SGCB(rs146888744)点突变相关心肌病<br>　　多西环素可抑制MMP活性，为探究多西环素是否可以抑制SGCB Hom鼠心肌病发展，对1月龄Hom小鼠和WT鼠用多西环素(6mg/ml)治疗1个月后进行检测。心脏超声表明Hom鼠收缩期IVS和LVPW与WT鼠比无统计学差异。HE结果显示Hom鼠心肌和骨骼肌炎细胞浸润明显减少，同时未见心肌坏死，提示早期使用多西环素可改善SGCB Hom鼠心肌病症状。<br>　　研究结论:<br>　　(1)成功构建出SGCB(rs146888744)点突变小鼠。<br>　　(2)SGCB Hom小鼠出现SGCB缺陷，同时DGC相关蛋白减少。<br>　　(3)SGCB Het鼠不致病，Hom鼠在2月龄时出现肥厚型心肌病表型，伴生理功能下降。<br>　　(4)SGCB(rs146888744)纯合点突变致心肌病机制可能与MMP2活性增高相关。<br>　　(5)多西环素可抑制SGCB Hom鼠心肌病进展。<br>　　研究背景:<br>　　急性心肌缺血再灌注损伤合并脓毒症均可导致心功能障碍以及相当高的死亡率。既往研究表明，治疗性浅低温(therapeutic mild hypothermia，TMHT)分别在心肌缺血再灌注损伤和严重脓毒症动物模型及患者中证实有改善心功能，缓解心肌损伤症状的效果，提示TMHT在急性心肌缺血再灌注损伤合并严重脓毒症的情况中可能也有心肌保护作用。<br>　　研究方法:<br>　　本研究选择8周龄的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重300-400g。大鼠到达实验室后，随机分为2组:TMHT（33±0.5℃）组(n=5)和常温（normothermia，NT，37±0.5℃）组(n=10)。NT组大鼠再分为2个亚组(n=5):疾病模型组接受心肌缺血再灌注损伤手术，再灌注开始同时注射内毒素;对照组接受假手术和生理盐水，2个亚组大鼠实验全程均维持在37±0.5℃。TMHT组大鼠接受心肌缺血再灌注损伤手术，再灌注同时注射内毒素并开始降温，15分钟内达到目标温度，维持机体在33±0.5℃。目标温度维持2小时后，取大鼠静脉血进行检测血乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）及肌酸激酶同工酶(creatine kinase，CK)-MB水平，大鼠心脏进行2，3，5-三苯基氯化四氮唑（triphenyte-trazoliumchloride，TTC）和伊文思蓝染色观察心肌梗死面积。免疫组化检测大鼠心肌肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α和Caspase-3表达。Western blot检测大鼠心肌NADPH氧化酶2(NADPH oxidase-2，NOX2)表达情况。<br>　　研究结果:<br>　　内毒素注射约15分钟后大鼠左心室压下降至基础值60％左右(约70mmHg)并维持，说明脓毒症模型建立成功。SD大鼠再灌注/TMHT维持2小时后，TTC及伊文思蓝染色显示，TMHT组大鼠心梗面积较常温维持(NT组)大鼠心梗面积减少41.7％（11.23±2.82vs.19.25±4.45，P=0.0093）。相应的，TMHT处理后的大鼠静脉血LDH和CK-MB水平均较对照有上升(1154.00±127.90vs.798.50±94.53;1110±118.80vs.830.00±43.86)，但无统计学差异(P=0.4642vs.P=0.2403)。而NT组LDH和CK-MB水平较对照有显著升高（2213.00±599.60vs.798.50±94.53，P＜0.0001;1731.00±688.10vs.830.00±43.86，P=0.0093）。免疫组化结果显示，尽管NT组大鼠心肌TNF-α表达较对照明显增加(26.80±5.03vs.7.89±2.79，P＜0.0001)，TMHT组大鼠心肌TNF-α表达较对照增加程度较少（13.22±1.47vs.7.89±2.79，P=0.0537），提示大鼠心肌炎症缓解。此外，TMHT组大鼠心肌Caspase-3表达较对照有少量上调(1.06±0.34vs.0.34±0.20，P=0.0462)，但NT组表达明显上调较对照明显(3.27±0.66vs.0.34±0.20，P＜0.0001)，提示TMHT组大鼠心肌凋亡缓解。Western blot结果示TMHT组中NOX2表达较对照上调（0.85±0.41vs.0.58±0.27，P=0.5727），但较NT组表达上调更明显(1.24±0.67vs.0.58±0.27，P=0.0822)，提示TMHT有减轻心肌氧化应激的作用。<br>　　研究结论:<br>　　TMHT可通过改善SD大鼠的心功能、减少心梗面积以及缓解心肌损伤保护心肌，可能是通过减轻心肌炎症、凋亡和氧化应激所实现。