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摘要本文主要从以下几个部分展开论述：<br>　　第一部分 嗅觉评估对先天性低促性腺激素性性腺功能减退症患者的鉴别诊断价值<br>　　目的：<br>　　利用中国人群嗅觉功能测试(COFT)工具评估CHH患者的嗅觉功能，比较分析嗅觉主观自评测试(SROS)和嗅神经MRI(MRI-OA)对KS的诊断价值，分析影响CHH患者嗅觉的因素，比较分析nCHH和KS患者治疗疗效及基因变异分布情况。<br>　　方法：<br>　　纳入2020年12月至2021年6月在北京协和医院内分泌科性腺门诊就诊的CHH患者。收集患者的临床资料。采集外周血提取白细胞DNA。采用目标序列捕获联合二代测序的方法筛选存在CHH相关致病基因罕见变异的患者。应用SROS和COFT评估患者嗅觉功能。SROS采用5级评分，分别为“差”、“中下”、“一般”、“中上”及“好”，自评为“好”、“中上”及“一般”为嗅觉功能正常;自评为“中下”及“差”为嗅觉功能异常。COFT由嗅觉阈值测试(CSTT)，嗅觉分辨测试(CSDT)和CSIT组成。三个试验总分(TDI)≥29.25分为嗅觉功能正常;TDI＜29.25分为嗅觉功能异常。利用MRI-OA评估CHH患者嗅觉通路结构，并测量嗅球大小(OBV)及嗅沟深度(OSD)。利用统计学方法比较nCHH及KS患者嗅觉功能及治疗结局。<br>　　结果：<br>　　1、临床特点:研究共纳入71例CHH患者，其中69例为男性，2例为女性。患者平均年龄为23.6±5.8岁，体重指数(BMI)为25.1±4.2kg/m2，平均血清黄体生成素水平为1.15±2.26U/L，卵泡刺激素水平为2.33±3.65U/L，总睾酮水平(T)为1.55±1.52ng/ml，雌二醇(E2)水平为20.31±11.66pg/ml。其中28例为初诊的患者，其余43例为已治疗的患者。这些患者中吸烟、饮酒和合并慢性鼻炎的比例分别为25％、28％和31％。<br>　　2、nCHH和KS患者嗅觉功能比较:根据COFT结果，36例患者为nCHH患者，35例为KS患者。SROS方面，nCHH患者中3例自评嗅觉功能为“好”，12例为“中上”，20例为“一般”，1例为“中下”。KS患者中，1例患者自评为“中上”，4例为“一般”，2例为“中下”，28例为“差”。MRI-OA方面，nCHH患者中67％（18/27例）的患者MRI未见明显异常，22％（6/27例）为单侧嗅球不发育或发育不良，11％（3/27例）为双侧嗅球不发育或发育不良。96％（27/28例）的KS患者MRI表现为双侧嗅球不发育或发育不良，4％(1/28例)未见明显异常。nCHH患者的嗅球体积及嗅沟深度大于KS患者(37.58±20.64vs2.40±10.72mm3，p=0.000;6.82±2.31vs2.64±3.07mm,p=0.000)。<br>　　3、嗅觉影响因素分析:TDI评分为因变量，年龄、BMI、随诊时间、T、E2、吸烟、饮酒、鼻炎、SROS、OBV及OSD为自变量进行线性回归分析。结果显示年龄、BMI、随诊时间、T、E2、吸烟、饮酒及鼻炎与嗅觉功能无显著相关性，SROS、OBV及OSD与嗅觉功能呈显著相关。<br>　　4、SROS及MRI-OA诊断价值比较:利用COFT为诊断KS的标准，SROS判断嗅觉功能的准确率为91.5％，诊断KS的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为85.7％、97.2％、96.8％和87.5％。MRI-OA判断嗅觉功能的准确率为92.7％，诊断KS敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为96.4％、88.9％、90.0％和96.0％。<br>　　5、治疗疗效分析:共26例促生精治疗男性CHH患者纳入分析，其中19例应用人绒毛膜促性腺激素联合人绝经期促性腺激素治疗，7例GnRH脉冲泵治疗，平均随访49.4±29.5月。患者开始治疗中位年龄20.5(17.8，26.0)岁，基线睾丸体积1.25(1.0，2.0)ml，血清LH水平为0.32(0.20，0.89)U/L，FSH水平为0.57(0.30，1.80)U/L，总睾酮水平为0.37(0.29，0.61)ng/ml。治疗后患者睾丸体积增加8.8±4.7ml，血清总睾酮水平提升2.6±1.6ng/ml。67％(14/21)的患者成功生精。平均生精时间是21.1±12.8月。nCHH和KS患者治疗结局无差异。<br>　　6、基因变异分析:共47例患者进行二代测序筛查可能的致病基因，其中51.0％(24/47)患者检测到CHH相关基因的罕见变异位点。根据ACMG指南，11个位点被评为致病/可能致病变异，致病变异检出率为23.4％。nCHH患者检出基因包括CHD7、FGFR1、DUSP6、FGF8、HESX1、PROKR2、PROP1及TACR3,KS患者检出基因包括ANOS1、CHD7、FGFR1、FGF17、IGSF10、EMA3A。<br>　　结论：<br>　　1、中国人群嗅觉功能测试对CHH患者的鉴别诊断具有一定价值，可作为嗅觉测试工具用于临床及科研。<br>　　2、嗅觉主观自评测试对判断“异常”嗅觉更可靠。<br>　　3、CHH患者存在嗅觉通路结构与功能不匹配的现象，单侧嗅球不发育或发育不良患者的嗅觉功能正常，而少数双侧嗅球不发育或发育不良的CHH患者嗅觉功能也正常，即存在“无明显嗅球的正常嗅觉”现象。<br>　　4、本研究中nCHH和KS患者治疗结局无显著差异。<br>　　5、本队列中CHH患者罕见变异检出率为51.0％，致病变异检出率为23.4％。nCHH患者中检出多种与GnRH神经元迁移相关的基因致病变异，提示基因检测对于鉴别nCHH和KS的价值有限。<br>　　第二部分 NDNF基因罕见变异患者的临床特点及变异位点致病性分析<br>　　先天性低促性腺激素性性腺功能减退症(Congenital hypogonadotropic hypogonadism，CHH)是一种罕见的单基因遗传病，临床主要表现为青春不发育和不育。目前已发现40多种的CHH相关致病基因。但仅有不到50％的患者可检测到致病基因变异，提示部分CHH的致病基因尚未明确。2020年Pitteloud团队在240例CHH患者中检测到4例存在神经元衍生的神经营养因子(neuron-derived neurotrophic factor，NDNF)基因罕见变异，并通过体外功能试验证实这些变异位点影响GnRH神经元迁移，提出NDNF基因是CHH患者的致病基因。但2021年的一项日本的研究在61例HH患者中仅检出9个NDNF基因同义变异，软件预测均为良性变异，提出NDNF基因致病性变异是CHH的罕见病因。因此目前NDNF基因是否为CHH患者致病基因尚待进一步研究证实。<br>　　目的：<br>　　本研究将对大样本量CHH患者进行基因变异的筛查，以明确NDNF基因致病性变异的发生率;分析NDNF基因罕见变异患者临床表型，并进行体外功能实验，验证变异位点致病性。<br>　　方法：<br>　　纳入2016年1月至2021年12月在北京协和医院内分泌科性腺门诊就诊的523例CHH患者，收集患者的一般临床资料。采集外周血提取白细胞DNA。采用全外显子组测序的方法，筛选存在NDNF基因罕见变异患者，用Sanger测序方法验证变异位点。利用生物信息学方法分析变异位点致病性。构建野生型及突变型NDNF真核表达载体，行体外功能实验，利用蛋白质印迹法(WB)验证变异对NDNF蛋白表达的影响。<br>　　结果：<br>　　(1)本研究在523例CHH患者中检测到7例患者存在NDNF基因罕见杂合变异，检出率为1.3％。7例患者中4例合并嗅觉障碍，为卡尔曼综合征患者，3例为嗅觉正常的CHH患者。他们平均就诊年龄为20.9±4.9岁，平均基础睾丸体积2.6±1.2ml，平均血清LH水平为0.38±0.42U/L，FSH水平为1.07±0.61U/L，总睾酮水平为0.78±1.17ng/ml。<br>　　(2)7个变异位点包含3个错义变异c.31C＞T(p.L11F)，c.769T＞G(p.F257V)和c.1430A＞G(p.K477R)，2个移码变异c.1656dupG(p.H553Afs*8)和c.1669dupT(p.Y557Lfs*4)和2个无义变异c.930C＞G(p.Y310*)、c.1483A＞T(p.K495*)。除c.31C＞T外，其他变异位点均位于NDNF基因4号外显子。根据ACMG指南，p.L11F是可能良性变异，p.F257V、p.K477R、p.H553Afs*8和p.Y557Lfs*4为临床意义未明的变异，p.Y310*和p.K495*为可能致病变异。<br>　　(3)WB结果显示7个变异在细胞中均有蛋白表达，其中L11F、F257V、K477R在培养基中检测到蛋白。<br>　　结论：<br>　　NDNF基因失活变异是CHH患者致病机制。本研究CHH患者队列中NDNF基因罕见变异检出率约为1.3％，致病/可能致病变异检出率率为0.4％;第4号外显子是NDNF基因变异的热点区域。NDNF基因变异患者临床可表现为先天性低促性腺激素性性腺功能减退症伴或不伴嗅觉功能障碍。