CDK12和EPRS在胃癌进展中的作用、机制及抑制剂研究-论文-万方医学网

CDK12和EPRS在胃癌进展中的作用、机制及抑制剂研究

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摘要目的： 　　2020年世界卫生组织和国际癌症研究机构发布的数据显示，胃癌在全球185个国家的36种癌症类型中，发病率排第四位，死亡率排第五位，是全球主要的健康负担。胃癌的主要风险因素包括幽门螺杆菌感染、EBV（Epstein-Barr virus）感染、家族史、饮酒、抽烟和肥胖等。其中约有80％的胃癌与幽门螺杆菌感染相关，慢性幽门螺杆菌感染能引起萎缩性胃炎，合并其它风险因素可发展成为胃癌。成功根除幽门螺杆菌能降低30％的胃癌发病风险，但幽门螺杆菌难以根除且容易反复感染，目前临床上缺乏有效的治疗萎缩性胃炎的药物，这增加了胃癌预防和治疗的难度。全球胃癌发病率最高的地区是亚洲，且集中在亚洲东部，而中国和日本则是胃癌发病率较高的国家。近年来，日本胃癌的发病率和死亡率逐渐降低，生存期逐渐升高，这得益于日本对胃癌的早期诊断和根除幽门螺杆菌的政策。中国的胃癌发病率和死亡率居高不下，大多数胃癌患者确诊时已处于晚期，而现在缺乏对晚期胃癌的有效的治疗手段，临床上缺乏用于胃癌的治疗靶点和有效的抑制剂。 　　在TCGA数据库中基于胃癌的数据挖掘显示CDK12(Cyclin-dependent kinase12)和EPRS/GluRS（Bifunctional glutamate/proline-tRNA ligase）在胃癌组织中表达量较高，且CDK12与EPRS具有相关性。CDK12是细胞周期依赖激酶，可以调控细胞周期、转录和翻译。已有的研究显示CDK12在人类癌症中扮演着重要的角色，既可以作为生物标志物，又可以作为治疗靶点。CDK12能参与PI3K/AKT信号通路、非经典的NF-κB信号路通、DNA损伤应答，并且能调控MYC的表达。CDK12在不同的癌症类型中功能不同，CDK12在前列腺癌中起着抑癌作用，在肝癌中起着促癌作用。然而，CDK12在胃癌中的作用还未被阐明。EPRS/GluRS是氨基乙酰-tRNA合成酶(Amino-acetyl-tRNA synthases，AARSs)超家族的成员，参与蛋白质的合成。目前，EPRS在癌症中的作用报道较少，已有的研究结果显示EPRS在乳腺癌中过表达，并且过表达的EPRS预测较差的生存期，提示EPRS可能在癌症中起着关键的作用。但是，EPRS在胃癌中的功能还未经报道。CDK12和EPRS的特异性抑制剂的研究仍在进行中，还未用于临床。计算机分子对接已经很好地用于药物研究，利用该技术结合FDA已经批准的临床药物的数据库可以用于CDK12和EPRS抑制剂的筛选。因此，研究CDK12和EPRS在胃癌中的作用、分子机制及抑制剂对于揭示胃癌新的治疗靶点和治疗策略意义重大。 　　在本研究中，分别对CDK12和EPRS在胃癌中的功能进行了深入的研究，明确了CDK12和EPRS在胃癌进展中的促进作用。进一步探讨CDK12和EPRS在胃癌进展中的分子机制，同时证实了CDK12和EPRS作为胃癌潜在治疗靶点的合理性、可行性及重要意义。此外，本研究借助计算机分子对接模拟初步筛选CDK12和EPRS的抑制剂，通过下拉试验、激酶实验和表面等离子体共振试验验证了盐酸丙卡特罗能与CDK12结合并抑制其激酶活性，黄当归酚（Xanthoangelol，XA）和4-羟基苦味素（4-hydroxyderricin，4-HD）能与EPRS结合并抑制其介导的信号通路，最后在细胞水平、人源性异种移植瘤小鼠模型(Patient-derived xenograft mouse model，PDX)、窗口期临床跟踪试验和幽门螺杆菌联合酒精诱导的小鼠胃癌模型中验证了盐酸丙卡特罗和XA及4-HD的安全性和有效性。最终揭示了CDK12和EPRS可能是胃癌新的治疗靶点，盐酸丙卡特罗和XA及4-HD有望用于临床治疗萎缩性胃炎和胃癌。 　　方法： 　　(1)探索CDK12在胃癌中的功能 　　首先在TCGA和GEPIA数据库中检索CDK12在胃癌组织中的表达，再用免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）的方法检测胃癌患者组织芯片中CDK12的表达，用免疫印迹（Western blot，WB）的方法检测CDK12在胃癌细胞中的表达。采用慢病毒介导的基因敲减技术或过表达技术下调或上调CDK12，用MTT和软琼脂克隆形成实验检测敲减或过表达CDK12对细胞增殖的影响，用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡的改变。在细胞源性异种移植瘤小鼠模型(Cell-derived xenograft mouse model，CDX)和PDX模型中验证CDK12下调对肿瘤生长的影响。 　　(2)揭示CDK12在胃癌进展中的作用机制 　　用免疫共沉淀和蛋白质谱分析并鉴定CDK12相互作用的蛋白，用免疫荧光获得CDK12与其相互结合蛋白在细胞中的定位。构建不同转录本的PAK2(p21activated kinase2，PAK2)表达载体，用免疫共沉淀鉴定CDK12与PAK2的结合区域。用WB检测下调或过表达CDK12后胃癌细胞中MAPK信号通路的变化，并用IHC在肿瘤组织中进行鉴定。用软件分析预测CDK12和PAK2的磷酸化状态，并用激酶实验进行验证。用磷酸化蛋白质谱分析PAK2的磷酸化位点并构建磷酸化位点突变的PAK2载体，进行表达和纯化，最后用激酶实验进行验证。过表达磷酸化位点突变的PAK2，用MTT、结晶紫平板克隆形成实验和CDX模型验证其对细胞增殖和肿瘤生长的影响。 　　(3)筛选CDK12的抑制剂 　　用计算机分子对接的方法筛选CDK12潜在的抑制剂，用下拉实验和激酶实验进行验证。用筛选到的CDK12潜在的抑制剂处理细胞，检测其对细胞增殖的作用，用IHC检测CDK12抑制剂对信号通路的影响。在PDX模型中验证筛选到的抑制剂对肿瘤生长的影响及其安全性。用IHC检测窗口期临床跟踪试验中CDK12的抑制剂对胃癌患者肿瘤组织中MAPK信号通路相关分子的影响。 　　(4)研究EPRS在胃癌中的生物学功能 　　用数据库和IHC分析并检测EPRS在胃癌组织中的表达，用WB检测EPRS在胃癌细胞中的表达。用MTT、结晶紫克隆形成和软琼脂克隆形成实验检测下调EPRS对细胞增殖和克隆形成的影响，并在CDX和PDX模型中进行验证。 　　(5)阐释EPRS促进胃癌进展的分子机制 　　用免疫共沉淀和免疫荧光检测EPRS与SCYL2的结合及在细胞中的定位。在数据库中检索并用IHC检测SCYL2在胃癌组织中的表达及其与EPRS表达的相关性，下调SCYL2后，用MTT，结晶紫平板克隆和软琼脂克隆形成实验检测SCYL2下调对细胞生长的影响。 　　结果： 　　(1)CDK12在胃癌进展中扮演着促癌的角色 　　CDK12在胃癌组织中的表达显著高于癌旁组织，且与患者的年龄呈正相关，年龄越大，CDK12的表达量越高。CDK12下调能显著抑制胃癌细胞的增殖，阻滞细胞周期在G2期，抑制CDX及PDX模型肿瘤的生长，过表达CDK12明显促进胃癌细胞的克隆形成。 　　(2)CDK12与PAK2结合并磷酸化PAK2激活MAPK信号通路 　　CDK12能与PAK2结合并共定位于细胞质和细胞核。PAK2在胃癌组织中表达增加，且与CDK12在相同患者肿瘤组织中的表达呈正相关，PAK2下调明显抑制胃癌细胞的增殖和肿瘤的生长。CDK12在苏氨酸134/169位点磷酸化PAK2激活MAPK信号通路。PAK2苏氨酸134/169磷酸化位点突变后能显著抑制胃癌细胞的增殖和肿瘤的生长。 　　(3)盐酸丙卡特罗是有效的CDK12的抑制剂 　　盐酸丙卡特罗能与CDK12结合并抑制其激酶活性，盐酸丙卡特罗能阻滞细胞周期在G2期并引起细胞凋亡。盐酸丙卡特罗口服溶液能显著抑制胃癌细胞的增殖和肿瘤的生长，且没有明显的毒性。盐酸丙卡特罗口服溶液能抑制窗口期临床试验患者胃癌组织中MAPK信号通路相关分子的表达。 　　(4)EPRS促进胃癌的进展 　　EPRS在胃癌组织中表达增加，且过表达的EPRS与胃癌患者的不良预后相关。EPRS的表达与P53和E-cadherin呈负相关，EPRS在突变型P53肿瘤组织中的表达高于野生型P53肿瘤组织中的表达。下调EPRS能显著抑制胃癌细胞的增殖和肿瘤的生长，EPRS促进胃癌的进展。 　　(5)EPRS与SCYL2结合增强WNT/GSK-3β/β3-catenin信号通路的转导并促进β-catenin在细胞核内的积累 　　EPRS能与SCYL2结合并共定位于细胞质。SCYL2在胃癌组织中的表达明显升高，且与EPRS的表达呈正相关。下调SCYL2能显著抑制胃癌细胞的生长，SCYL2对胃癌的发展起着重要的作用。 　　结论： 　　CDK12与PAK2结合并在苏氨酸134/169位点磷酸化PAK2，进而激活MAPK信号通路，促进细胞的增殖和肿瘤的生长，盐酸丙卡特罗是有效的CDK12的抑制剂，且没有明显的毒性。表明CDK12可能作为新的胃癌治疗靶点，盐酸丙卡特罗作为CDK12的抑制剂有望用于临床胃癌的预防和治疗。 　　EPRS与SCYL2结合增强WNT/GSK-3β/β-catenin信号的转导和β-catenin在细胞核内的积累，促进细胞的增殖和肿瘤的生长，XA和4-HD作为EPRS的抑制剂显著抑制肿瘤的生长和幽门螺旋杆菌联合酒精诱导的萎缩性胃炎和胃癌的形成。提示EPRS可能是潜在的胃癌治疗靶点，XA和4-HD有望用于临床预防和治疗萎缩性胃炎和胃癌。