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摘要目的<br>　　肺癌居恶性肿瘤死亡率的首位，有效地鉴别组织中癌症与炎症区域，辅助肺癌的诊断，对提高患者生存期意义重大。纳米探针因具备信号增强效应常被用于提高对肿瘤检测的灵敏度，但尚不能有效鉴别肿瘤和炎症。本研究采用自组装方式构建超分子荧光纳米探针(Self-assembledsupramolecularnanoprobe，SSNP):以β-环糊精聚合物(β-cyclodextrinpolymer，poly-β-CD)为主体分子，金刚烷衍生化染料为客体分子，结合核酸适配体(Aptarner)对肿瘤细胞的特异性识别及叶酸(Folate)靶向识别炎症反应时活化的巨噬细胞表面叶酸受体的性质，分别构建SSNP-Aptamer(Aptamer靶向的自组装超分子荧光纳米探针)与SSNP-Folate(Folate靶向的自组装超分子荧光纳米探针)。在研究SSNP-Aptamer与SSNP-Folate对人肺腺癌细胞、活化的巨噬细胞和正常细胞识别的基础上，将其进一步应用于对肺腺癌组织、炎症组织和正常组织的区分。基于该自组装方法构建一种简便的、灵敏的、特异性的、可同时区别炎症和癌症的新标记技术，可为环境因素等导致的肺腺癌提供有价值的检测方法和技术支持。<br>　　方法<br>　　1.SSNP-Aptamer与SSNP-Folate超分子荧光纳米探针的设计与制备<br>　　首先，合成超分子荧光纳米探针所需的各个模块分子:β-环糊精聚合物(poly-β-CD)、金刚烷衍生化罗丹明(Adamantane-labeledrhodamineB，Ad-R)、金刚烷衍生化菁染料5.5(Adarnantane-labeledcvanine5.5，Ad-C)、金刚烷衍生化的Aptamer(Adamantane-labeledaptamer，Ad-aptamer，用于特异性识别人肺腺癌细胞A549)和金刚烷衍生化的叶酸(Adamantane-labeledfolate，Ad-Folate，用于靶向识别炎症反应时活化的巨噬细胞表面的叶酸受体)。<br>　　其次，制备装配不同靶向分子的自组装超分子荧光纳米探针:(1)通过在水溶液中按一定比率依次混合poly-β-CD、Ad-R和Ad-aptamer，即可制备SSNP-Aptamer(poly-β-CD/Ad-R/Ad-aptamer):(2)通过在水溶液中按一定比例依次混合poly-β-CD、Ad-C和Ad-Folate，即可制备SSNP-Folate(poly-β-CD/Ad-C/Ad-Folate)。<br>　　2.超分子荧光纳米探针的相关性能研究<br>　　采用扫描电子显微镜(SEM)和动态光散射仪(DLS)对SSNP-Aptamer和SSNP-Folate的纳米结构形貌和粒径进行表征;利用琼脂糖凝胶电泳分别对SSNP-Aptamer和SSNP-Folate的结合稳定性进行考察;考察两种探针的体外荧光光谱性质、光稳定性及荧光增强效应等;为进一步在细胞及组织层面进行相关应用，对两种探针对细胞存活率的影响进行考察。<br>　　3.超分子荧光纳米探针对人不同细胞的区分效果研究<br>　　首先以THP-1细胞构建体外活化的巨噬细胞(M2型巨噬细胞)模型，采用RT-qPCR对M2型巨噬细胞标志基因(IL-10和CD206)的表达情况进行检测，以验证M2型巨噬细胞细胞模型构建情况:进一步用RT-qPCR对A549细胞、活化的巨噬细胞(M2型巨噬细胞)和正常细胞(BEAS-2B细胞)的叶酸受体基因表达情况进行考察;随后联合运用SSNP-Aptamer和SSNP-Folate两种探针组成的混合体系，在冰上分别与三种细胞进行孵育，并通过激光共聚焦显微镜成像对SSNP-Aptamer和SSNP-Folate探针对上述三种细胞的识别区分效果进行研究。<br>　　4.超分子荧光纳米探针对不同组织的区分效果研究<br>　　选取A549肺腺癌小鼠移植瘤病理组织切片作为研究样本，联合运用制备的自组装超分子荧光纳米探针(SSNP-Aptamer和SSNP-Folate)，考察其对肺腺癌组织、炎症组织和正常组织的区分效果，并与组织病理结果比较，从而论证本研究中构建的模块化自组装超分子荧光纳米探针是否有效地用于区分肺腺癌和炎症。<br>　　结果<br>　　1.超分子荧光纳米探针及其模块分子的相关表征<br>　　(1)模块分子的分子量表征:poly-β-CD的凝胶渗透色谱(GPC)图显示其数均分子量为94417Da;质谱结果显示Ad-R脱去Cl-后的离子峰检测分子量为651.2Da，其理论分子量是651.3Da;Ad-C脱去Cl-后的离子峰检测分子量为716.45772Da，其理论分子量是717.ODa;Ad-Aptamer形成钠离子加合峰后的检测分子量为17512.3Da，其理论分子量应为17519.4Da;Ad-Folate加上质子氢后的检测分子量为575.27197Da，其理论分子量是575.6Da。上述结果表明模块分子已成功制备。<br>　　(2)探针的结合性能:首先测得poly-β-CD与Ad-R结合常数为2.5×103L/mol，poly-β-CD与Ad-C结合常数为2.7×l03L/mol:进一步地，琼脂糖电泳结果说明探针SSNP-Aptamer和SSNP-Folate在电场作用下均未出现迁移，并且出现明亮条带。以上结果表明SSNP-Aptamer和SSNP-Folate均形成了稳定的超分子复合物。SEM显示，poly-β-CD形状无定形，合成的SSNp-Aptamer和SSNP-Folate形状呈球形纳米颗粒，粒径大小分别为96nm、110nm，其对应的水合粒径分别为154nm和163nm。电泳结果和粒径表征结果表明两种超分子荧光纳米探针己成功制备。<br>　　(3)探针的荧光性能:荧光光谱显示SSNP-Aptamer比Ad-R的荧光强度增强了约3.5倍，SSNP-Folate比Ad-C的荧光强度增强了约72倍;说明环糊精与金刚烷衍生化染料分子形成包络复合物后荧光性能改善，具有增敏效果，特别是对Cy5.5的荧光增敏效果极其明显。进一步测试探针在不同溶液体系(PBS和10％FBS培养基)中经7W紫外灯连续照射10h的荧光性能，两种探针的荧光强度仍可保持在初始荧光强度的90％以上，表明SSNP-Aptamer和SSNP-Folate具备高的光稳定性和荧光增敏效应。<br>　　(4)细胞毒性:经MTS实验验证SSNP-Aptamer和SSNP-Folate对细胞的毒性较低，细胞存活率达85％以上，因此，表明构建的两种纳米探针可以运用到细胞和组织中进行成像研究。<br>　　2.超分子荧光纳米探针对人肺腺癌细胞、活化的巨噬细胞和正常细胞的区分效果<br>　　THP-1细胞在100ng/mLPMA刺激48h，20ng/mLIL-4刺激48h的条件下，获得的M2型巨噬细胞经ImqPCR检测显示其标志基因IL-10和CD206的表达量均比M0型巨噬细胞高，表明成功获得了活化的巨噬细胞。同时进一步检测BEAS-2B细胞，A549细胞和M2型巨噬细胞中叶酸受体基因的表达水平，BEAS-2B细胞中FR-βmRNA表达量远高于FR-αmRNA，说明三种细胞的FR基因表达水平主要取决于FR-βmRNA表达水平;而三种细胞中FR-βmRNA表达水平为:M2型巨噬细胞＞BEAS-2B细胞＞A549细胞。激光共聚焦成像结果显示混合探针体系能够有效识别三种细胞，A549细胞呈现绿色荧光，BEAS-2B细胞只有微弱的红色荧光，M2型巨噬细胞呈现红绿混合的黄色荧光。<br>　　3.超分子荧光纳米探针对肺腺癌组织、炎症组织和正常组织的区分效果<br>　　SSNP-Aptamer和SSNP-Folate混合探针体系与癌旁组织切片进行孵育，共聚焦成像结果显示探针体系能有效区分肿瘤区域、炎症区域和正常组织区域，其成像结果与病理脏染色和IHC染色结果一致，肿瘤组织部位呈明亮绿色荧光，炎症部位呈红绿混合的黄色荧光，正常组织部位无明显荧光。成像结果表明所构建的探针体系在A549肺腺癌小鼠移植瘤模型中可有效区分肺腺癌组织、炎症组织和正常组织。<br>　　结论<br>　　本研究基于自组装超分子荧光纳米探针，联合运用核酸适配体对人肺腺癌细胞的特异性识别及叶酸可靶向识别炎症反应时活化的巨噬细胞表面叶酸受体的性质，构建了一种简便的、灵敏的、特异性的、可同时区别炎症和癌症的标记技术。成功实现了A549肺腺癌小鼠移植瘤模型中肺腺癌组织、炎症组织和正常组织的有效区分。