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摘要背景：<br>　　原发性食管恶性黑色素瘤(primary malignant melanoma of the esophagus，PMME)是一种高度侵袭性的黏膜黑色素瘤，因早期发生淋巴或血源性扩散而被视为全身性疾病。预后较差，5年生存率约为4％-37％。PMME是一种罕见的病变，仅占食管恶性肿瘤的0.1％-0.2％，在所有黑色素瘤亚型中占比低于0.5％。自1906年Baur报道首例PMME以来，全球范围内仅报道PMME300余例，且多以个案或小系列报道为主。此外，PMME的发病机制尚不清楚，目前仍无标准的治疗方案，现有治疗手段以根治性食管切除术为主，辅以冷冻治疗、放化疗、免疫治疗及靶向治疗等。<br>　　目前，全外显子测序(whole exome sequencing，WES)已经广泛应用于肿瘤的研究，使我们对肿瘤发生发展的分子机制有了更进一步的了解。皮肤黑色素瘤、肢端黑色素瘤、黏膜黑色素瘤及葡萄膜黑色素瘤的发生发展相关的基因与遗传学改变、分子病理学机制已有广泛的研究。而PMME由于发病率极低，关于其基因突变特征多以小队列或个案研究为主，缺乏多中心或大样本的研究，其分子遗传学特征有待进一步深入研究。此外，尚无针对中国PMME患者的肿瘤全外显子测序研究。<br>　　RNF139和PAPSS2均为蛋白翻译后修饰相关基因。RNF139属于E3泛素连接酶，通过泛素化发挥肿瘤抑制作用。PAPSS2是硫酸化途径中编码限速酶的基因，参与体内多种代谢调节。有研究人员通过分析计算数据库，预测RNF139和PAPSS2是黑色素瘤驱动基因，但目前没有确切实验数据支撑此预测。<br>　　本文中，我们对来自食管癌防治国家重点实验室的15例PMME肿瘤标本进行WES生物信息学分析，并对潜在驱动基因进行体外生物学功能验证，以深入了解这一罕见的黏膜黑色素瘤，进一步阐明PMME的诊断和治疗靶点。<br>　　方法：<br>　　1.对我们团队前期研究的180例PMME患者进行筛选，同时对从石蜡组织中提取的DNA进行质量评估，筛选出符合要求的病例进行WES。<br>　　2.对PMME患者肿瘤组织及瘤旁正常组织进行全外显子测序，分析体细胞单核苷酸变异(single nucleotide variation，SNV)、插入和缺失(insertion-deletion，INDELs)等，以评估突变在PMME中的分布，将PMME与食管癌、胃腺癌、皮肤黑色素瘤和葡萄膜黑色素瘤的突变图谱进行比较。<br>　　3.使用MuSiC软件进行肿瘤显著突变分析，找到显著突变基IN(significantly mutated genes，SMGs)，并通过KEGG数据库，对显著突变基因相关通路进行富集分析。<br>　　4.通过免疫组织化学染色检测PMME肿瘤组织及瘤旁正常黏膜组织中RNF139和PAPSS2表达差异。<br>　　5.潜在驱动基因RNF139和PARSS2对黑色素瘤细胞A375生物学功能影响:将构建的过表达RNF139质粒和过表达PAPSS2质粒转染至黑色素瘤细胞A375中，应用qRT-PCR和Western Blot检测转染效率，MTS法检测细胞增殖能力，划痕实验检测细胞迁移能力，流式细胞术分析细胞凋亡情况。<br>　　结果：<br>　　1.对筛选出的15例PMME患者临床病理特征进行统计，结果表明PMME多为男性患者(14/15)，治疗方案以手术治疗为主(14/15)。<br>　　2.通过对15例PMME患者WES结果进行生物信息学分析，共识别了65293个突变，平均突变负荷为37.8/Mb(2.9-142.6)。其中C＞T/G＞A突变类型在大多数样本中占主导地位(12/15)。将PMME与食管癌、胃腺癌、皮肤黑色素瘤和葡萄膜黑色素瘤的突变图谱比较发现，相较于消化道肿瘤，PMME与皮肤黑色素瘤和葡萄膜黑色素瘤的关系更为密切。<br>　　3.我们在PMME肿瘤中发现PTEN、PIK3R1、FMNL2、DROSHA、RNF139、PAPSS2、EIF283、ROR1和TTN显著突变基因，KEGG通路分析显著突变基因共富集到12条相关通路，其中RNF139、PAPSS2和EIF2B3是黑色素瘤中从未报道过的基因，且RNF139和刚PAPSS2均与蛋白翻译后修饰和细胞衰老相关。<br>　　4.免疫组化结果表明，相较于正常组织，PMME肿瘤组织中RNF139和PAPSS2表达量降低。<br>　　5.在A375细胞中，过表达RNF139和PAPSS2可抑制细胞增殖，抑制细胞迁移，诱导细胞凋亡。<br>　　结论：<br>　　蛋白翻译后修饰相关基因RNF139和PAPSS2的突变是PMME的潜在驱动机制之一，通过突变图谱比较发现，相较于胃腺癌和食管癌，PMME与皮肤黑色素瘤和葡萄膜黑色素瘤关系更密切，RNF139和PAPSS2可能在黑色素瘤细胞的生物学功能中起到重要作用。