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摘要背景<br>　　新型冠状病毒(2019-nCoV)有很强的传播力和致病性，目前已在全世界流行，造成2亿多人的感染和400多万人的死亡，给全球的医疗资源和经济发展带来极大的压力。接种疫苗是预防新型冠状病毒流行的有效手段，目前国内外有多个厂家的疫苗已经获批上市，包括BioNTech/辉瑞和Modena的RNA疫苗，阿斯利康和康希诺的腺病毒载体疫苗，科兴和国药集团的灭活疫苗等。公开的数据显示，各种疫苗的有效率分别为95％、94.1％、70％和79％，其中灭活疫苗价格相对适中，并且只需2-8℃运输，利于在非发达国家普遍应用。目前中国生物的新冠病毒灭活疫苗已在中国、阿联酋、巴林、埃及境内获批紧急使用。<br>　　新冠病毒感染和疫苗免疫后，体内浆细胞会分泌能与免疫原（或病原体）结合的免疫球蛋白（抗体），其中部分免疫球蛋白（抗体）能与病原体结合，进而阻断病原体侵入机体发生感染，这部分免疫球蛋白就是中和性抗体。新冠病毒中和抗体主要靶向RBD特定区域，能阻断病毒RBD与细胞受体ACE2的结合，阻断感染。《重型和危重型新型冠状病毒肺炎诊断和治疗专家共识》中建议将含有新型冠状病毒抗体的人恢复期血浆用于病情进展较快、重型和危重型患者，可以作为特异性治疗的一种选择。全美最佳医院MayoClinic认为中和抗体检测能够提供病人抗体中和效果的关键信息，进而更好地筛选恢复期血浆捐献者。中和抗体检测可获取疫苗在人体产生的免疫应答抗体滴度，且可以作为伴随诊断产品，明确疫苗的保护效果和保护时间、需要的中和抗体滴度。WHO流调方案中推荐中和抗体检测可作为IgM、IgA或IgG抗体检测阳性或可疑结果的进一步补充分析，通过中和抗体检测，可获知社会群体的免疫水平，指导复工复产及新冠疫情防控策略。最近由曹彬教授和张定宇院长开展的新冠患者随访研究结果公布，随访结果显示，新冠患者出院后6个月中和抗体阳性率由急性期的96.2％下降至58.5％，平均滴度从19下降至10，提示新冠感染后产生的中和抗体保护力会在短时间内下降，但新冠疫苗接种后，中和抗体的变化情况是否和新冠感染者康复后变化规律一样，目前并不清楚。WHO认为基于抗体检测获得‘免疫护照’有可能加剧疫情传播，建议在测定常规血清抗体的同时，如有条件也需要测定中和抗体，这样才能更好的筛选出免疫保护性人群。<br>　　目的<br>　　中和抗体检测的金标准为活病毒中和试验(空斑减少中和试验，PRNT)，该方法实验条件需要培养活病毒和细胞，在P3实验室由高度熟练的工作人员通过复杂的实验室程序来操作，这些步骤既不便捷，又需要花费几天时间才能获得结果，不适用于大规模的疫苗接种后效果评估。因此需要一种检测方便，通量高，可满足大规模检测需求的中和抗体检测方法。本研究利用纳米磁微粒技术、酶促化学发光技术、蛋白质偶联技术和免疫学抗原抗体反应技术，借助安图生物的磁微粒化学发光技术平台，建立一种高通量、快速、全自动尽量减少人工操作的的中和抗体检测方法。对建立的中和抗体检测方法性能，包括灵敏度、特异性、重复性、稳定性等性能指标进行评估，以满足大规模规范检测的需求，并用建立的方法对疫苗接种后中和抗体的变化规律进行监控，为加强免疫时机提供数据支持。<br>　　方法<br>　　1.磁微粒混悬液的制备<br>　　利用EDC和NHS活化羧基表面磁微粒，形成活性中间体，然后加入基因重组表达的同源二聚体ACE2蛋白（Fc标签），通过化学链接的方法将ACE2蛋白固定到磁微粒表面，然后加入含有蛋白和多羟基化合物的保存液。<br>　　2.酶结合物的制备<br>　　利用过碘酸钠将辣根过氧化物酶上的糖基氧化为醛基，然后加入基因重组表达的新型冠状病毒RBD蛋白，通过化学链接的方法将RBD蛋白与辣根过氧化物酶偶联呈复合物，然后稀释在含有蛋白和表面活性剂的稀释液中。<br>　　3.反应体系的建立<br>　　选择样本的稀释比例，样本、样本稀释液、磁微粒混悬液、酶结合物的加样量和加样顺序、反应时间，让样本中的中和抗体和磁微粒上包被的ACE2蛋白与酶结合物中的RBD蛋白充分竞争结合。<br>　　4.试剂盒参考区间的建立<br>　　选择未感染过新型冠状病毒，也未注射过新型冠状病毒疫苗的不同人群样本，和新型冠状病毒疫苗注射后人群样本。以活病毒中和抗体检测抗体效价大于等于1∶4为阳性标准，应用ROC曲线法(ReceiverOperatingCharacteristicCurve)确定参考区间，即假设不同临界浓度值下检测的灵敏度和特异性，以Youden指数（Youden指数=敏感度+特异性-1）最大的点为临界参考值。<br>　　5.试剂盒性能评估<br>　　灵敏度:以活病毒中和试验为金标准，活病毒中和抗体检测效价大于等于1∶4为阳性（有中和抗体）。灵敏度=本试剂盒检出阳性数量/活病毒中和抗体阳性数量×100％。<br>　　交叉反应:验证与以下病原体抗体的交叉反应，包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、地方性人类冠状病毒、风疹病毒、呼吸道合胞病毒、肠道病毒、腺病毒、肺炎衣原体、肺炎支原体、麻疹病毒、腮腺炎病毒。<br>　　特异性:检测2019年12月之前不同人群样本，包括呼吸道感染的儿童、呼吸道感染的成年人、高血压患者、心肌炎症患者、正常体检人群。特异性=本试剂盒检出阴性数量/总样本数量×100％。<br>　　精密性:用5个水平样本，包括阴性样本、临界阳性样本、阳性样本。每个样本上午、下午各进行1次3孔检测，连续检测4天，每个样本共得到24个数据，分别计算阳性样本和弱阳性样本的24个数据的平均值、标准差，精密性变异系数=标准差/平均值×100％。<br>　　稳定性:试剂拆封后载入仪器中7天，载机温度为2℃～10℃，试剂随仪器试剂盘不停转动。拆封载机放置后测定的结果与载机0天的结果计算偏差，偏差计算公式（载机放置后浓度值-载机0天浓度值）/载机0天浓度值×100％。<br>　　6.新型冠状病毒感染者中和抗体监测<br>　　新型冠状病毒感染者，包括轻型、普通型和重型。急性期（发病后2周内）、恢复期1个月、3个月、6个月，分别采集血清样本冻存，用本试剂盒检测中和抗体浓度，监测中和抗体浓度随时间的变化趋势。<br>　　7.新型冠状病毒灭活疫苗免疫后中和抗体监测<br>　　新型冠状病毒疫苗注射第一针后1周、2周、3周、4周，注射第二针后1周、2周、3周、4周、6周、10周、16周，分别采集血清样本冻存，用本试剂盒检测中和抗体浓度，监测中和抗体浓度随时间的变化趋势。<br>　　结果<br>　　1.用HEK293细胞重组表达的ACE2蛋白偶联羧基表面磁微粒制备磁微粒混悬液，ACE2蛋白是带有人Fc标签的同源二聚体，单体分子量127.3KD，纯度86.5％。ACE2蛋白偶联磁微粒的活化缓冲液选择PH值4.7-5.0的酸性缓冲液，活化时间1小时;偶联缓冲液选择PH值中性的PBS缓冲液，偶联时间2小时;蛋白偶联量为0.04μg/测试。选择Bis-tris缓冲液加1％BSA可以保护ACE2蛋白活性，添加5％甘油+5％蔗糖组合可改善磁微粒组分的冻融稳定性。<br>　　2.用HEK293细胞重组表达的RBD蛋白(319aa-541aa)偶联辣根过氧化物酶制备酶结合物，RBD蛋白C末端带6个His标签，分子量32.8KD，纯度96.5％。RBD蛋白与辣根过氧化物酶偶联的最佳条件是，过碘酸钠氧化20分钟;偶联摩尔比1∶2;反应时间16小时。酶结合物在Bis-Tris缓冲液加1％BSA、0.2％Casein和0.1％吐温20的稀释液中稳定性最优，发光值降幅约15％。<br>　　3.样本稀释液选择Tns-NaCI缓冲液加1％Casein和防腐剂。校准品选择兔抗RBD多克隆中和抗体，稀释在人血清中制备，基质效应最小。校准品溯源至新型冠状病毒(2019-nCoV)中和抗体WHO标准品20-136。<br>　　4.选择竞争一步法反应模式，样本不需要预稀释，样本量20ul，样稀量50ul，酶结合物加样体积50ul，阴阳反差较大，结果报告时间最快17分钟。<br>　　5.Youden指数最高点的临界值浓度值为22.3IU/ml。<br>　　6.本方法试剂盒以30IU/ml为临界值，灵敏度为93.78％，以20IU/ml为临界值，灵敏度为96.27％;特异性大于99.5％;精密性变异系数CV＜10％。<br>　　7.本方法试剂盒检测新型冠状病毒感染患者，发现多数感染者中和抗体在感染1个月时达到峰值，后逐渐下降，从感染1个月到6个月，中和抗体滴度平均下降60-70％。轻型患者中和抗体水平明显低于普通型和重型。<br>　　8.本方法试剂盒检测新型冠状病毒疫苗免疫后，中和抗体阳性率持续升高，全程两针疫苗后3-4周，抗体阳性率98％以上。大部分个体在第二针后3-4周抗体滴度达到峰值，3-4个月中和抗体阳性率出现较大幅度下降，至6个月，中和抗体阳性率已不足30％。<br>　　结论<br>　　本研究借助磁微粒化学发光技术平台，建立一种高通量、快速、全自动新冠病毒中和抗体检测试剂盒，对建立的中和抗体检测方法性能，包括灵敏度、特异性、重复性、稳定性等性能指标进行了评估，并用建立的方法对疫苗接种后中和抗体的变化规律进行监控，有效评价疫苗免疫效果并为加强免疫时机提供数据支持。