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摘要背景及目的<br>　　流行病学研究表明，膜性肾病的发病率和患病率越来越高。侯凡凡院士团队发表于美国肾脏病学会杂志的研究表明，膜性肾病患病率逐年升高，可能与长期暴露于大气PM2.5相关，其发病机制尚未完全阐明。<br>　　PM2.5是指空气中直径≤2.5微米的颗粒物，携带多种致病分子可以直接进入呼吸道导致呼吸系统疾病，其某些成分甚至通过气血屏障进入血液循环从而增加心脑血管疾病、肾脏疾病患病风险。研究表明，PM2.5主要由水溶性无机离子、无机元素成分、碳质气溶胶以及多环芳烃等组成，而多环芳烃中含量最大的为苯并[b]荧蒽(BbF)，其具有致癌、致畸和致突变等多种毒性作用。我们团队前期的研究结果表明，在体外实验中，苯并[b]荧蒽导致足细胞损伤且焦亡相关蛋白NLRP3及caspase-1表达增多。多项研究显示，PI3K/AKT信号通路参与细胞焦亡。且在预实验中我们使用PI3K的抑制剂BE2235对苯并[b]荧蒽诱导的足细胞损伤模型进行干预，发现细胞焦亡相关蛋白的表达随着挽救实验而显著下调，意味着焦亡减弱。这提示苯并[b]荧蒽可能是通过激活PBK/AKT信号通路导致足细胞发生焦亡引起足细胞损伤。<br>　　据此我们假设:PM2.5中苯并[b]荧蒽经呼吸道进入体内，通过血液循环进入肾脏，到达足细胞激活PI3K/AKT信号通路，促使足细胞焦亡参与特发性膜性肾病发生。本研究拟从体外及体内实验，采用分子生物学技术及病理方法探索苯并[b]荧蒽对肾脏的损害及其发生的分子机制，为研究特发性膜性肾病发生机制及其防治提供新思路。<br>　　方法<br>　　本研究选取永生化小鼠足细胞(MPC)作为细胞实验的研究对象，选取16周SD雄性大鼠作为动物实验的研究对象，选取病理上确诊为特发性膜性肾病的患者为临床实验的研究对象。<br>　　1.细胞实验:应用不同浓度(0μg/ml，6.25μg/ml，12.5μg/ml，25μg/ml)的苯并[b]荧蒽刺激小鼠足细胞观察72小时，和应用相同浓度（25μg/ml）的苯并[b]荧蒽刺激小鼠足细胞观察不同时间(0h，24h，48h，72h)。①提蛋白后，通过蛋白免疫印迹分析焦亡的相关蛋白NLRP3、caspase-1的表达变化和P13K/AKT信号通路相关蛋白PI3Kp110、PI3Kp85、AKT、p-AKT的表达变化。②进行免疫荧光验证是否激活PI3K/AKT信号通路。③应用BE2235抑制PI3K/AKT信号通路观察足细胞焦亡相关蛋白水平变化。<br>　　2.动物实验:购买于河南省实验动物中心16周SD雄性大鼠12只，并饲养于河南省实验动物中心，根据预实验的方法分为4组:对照组(BbF0mg/kg)、BbF1.5mg/kg、BbF7.5mg/kg、BbF37.5mg/kg。通过可视化气管滴注的方式进行给药，分别于给药前(0天)、给药后第3天、第7天、第14天分别收集大鼠血液和尿液，用于检测苯并[b]荧蒽浓度、肾功能和尿蛋白，并于给药后第14天处死大鼠取肺组织和肾组织用于做病理和分子生物学技术。<br>　　①收集大鼠的全血进行质谱分析检测苯并[b]荧蒽浓度。②血清用于检测血肌酐和抗PLA2R抗体。③尿液用于检测尿蛋白。④肾脏标本用于病理观察是否发生膜性肾病特征性改变。⑤肾脏的部分组织用于提蛋白，应用蛋白免疫印迹实验分析足细胞标记蛋白nephrin、podocin和足细胞损伤标志蛋白desmin的表达变化，焦亡的相关蛋白NLRP3、caspase-1的表达变化。<br>　　3.临床实验:收集特发性膜性肾病患者血液和健康对照人血液进行质谱分析检测苯并[b]荧蒽浓度，比较差异。<br>　　结果<br>　　1.大鼠实验证实苯并[b]荧蒽经肺进入血液循环且比对照组含量高:与对照组相比，BbF给药组随着给药浓度越高，大鼠血中能检测到BbF浓度越高，存在显著差异。<br>　　2.大鼠实验证实苯并[b]荧蒽损害肾功能:①随着BbF给药浓度越大和体内时间延长，肌酐值逐渐升高，且有显著差异。②尿点式白蛋白也显著升高。<br>　　3.大鼠实验证实苯并[b]荧蒽致足细胞损伤:随着给药浓度增大，足细胞结构蛋白nephrin、podocin表达减少，足细胞损伤标志蛋白desmin表达增多，且存在显著性差异。<br>　　4.细胞实验及大鼠实验证实苯并[b]荧蒽致足细胞发生焦亡:①细胞实验:不同浓度BbF刺激MPC检测焦亡指标，随着BbF浓度增大，焦亡相关指标NLRP3及caspase-1表达增多，且存在显著性差异。②细胞实验:最适相同浓度下不同时间BbF刺激MPC检测焦亡指标，随着时间延长，焦亡相关指标NLRP3及caspase-1表达增多，且存在显著性差异。③动物实验:不同浓度(0mg/kg、1.5mg/kg、7.5mg/kg、37.5mg/kg)的BbF暴露后随着给药浓度增大，足细胞焦亡的相关指标NLRP3、caspase-1、IL-18和IL-1β表达增多，且存在显著性差异。<br>　　5.细胞实验证实苯并[b]荧蒽激活PI3K/AKT通路:随着刺激浓度的增大和作用时间的延长，催化亚基PI3Kp110及调节亚基PI3Kp85蛋白表达水平显著升高，p-Akt的蛋白表达水平显著升高。<br>　　6.苯并[b]荧蒽可能通过激活PI3K/AKT通路诱导足细胞发生焦亡:①与BbF0μg/ml相比，BEZ组中PI3Kp110、PBKp85、p-Akt等PBK/AKT通路相关指标表达减少，且存在显著差异(P＜0.05)，并且焦亡相关蛋白NLRP3和caspase-1相应表达减少;②与BbF0μg/ml相比，BbF25μg/ml组PBKp110、p-Akt等PI3K/AKT通路相关指标表达增多，且存在显著差异(p＜0.05)，并且焦亡相关蛋白NLRP3和caspase-1相应表达增多，提示苯并[b]荧蒽可能通过激活PI3K/AKT信号通路诱导足细胞发生焦亡。<br>　　7.抗PLA2R抗体滴度结果阴性:大部分检测结果＜5RU/ml，少部分结果高于5RU/ml，但≤14RU/ml，正常参考范围为≤14RU/ml。<br>　　8.细胞免疫荧光发现BbF可以进入足细胞胞质和胞核。<br>　　9.特发性膜性肾病患者血液中苯并[b]荧蒽浓度显著高于正常健康人。<br>　　结论<br>　　1.大气细颗粒物中有机成分苯并[b]荧蒽可以经过肺进入循环系统并作用于肾脏造成肾脏的损伤，肾脏损伤的机制可能是苯并[b]荧蒽通过激活PI3K/AKT信号通路引起足细胞发生焦亡。<br>　　2.苯并[b]荧蒽可以进入足细胞胞质和胞核。<br>　　3.苯并[b]荧蒽可能是造成PM2.5相关膜性肾病的主要物质。