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摘要背景<br>　　高龄女性生育力下降，辅助生殖治疗后妊娠率及活产率显著低于年轻女性，而胚胎致死、流产、以及先天性出生缺陷等不良事件发生概率显著高于年轻女性，这些主要是由卵巢衰老引起的卵巢储备及卵子质量下降所致。<br>　　线粒体是细胞进行有氧呼吸的主要场所，参与维持细胞生命活动和物质代谢。在颗粒细胞及卵母细胞的生长发育中线粒体起重要作用，是决定卵巢储备和卵子质量的重要因素。卵巢衰老过程中线粒体功能下降会导致颗粒细胞及卵母细胞内氧化呼吸链受损、活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS)积累，引起颗粒细胞凋亡增多;同时，卵母细胞内DNA双链断裂修复异常、减数分裂异常，最终导致卵母细胞质量下降，进一步影响其受精及胚胎发育潜能。<br>　　烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NicotinamideAdenineDinucleotide，NAD+)是体内多种酶促反应所需的代谢辅助因子，且参与多种不同的细胞信号传导途径，在细胞中主要维持能量代谢，参与调控细胞基因组稳定性及线粒体功能。NAD+合成通路主要包括从头合成途径(Denovopathways)、PH途径(Preiss-Handlerpathway)以及补救途径(Salvagepathways)。在哺乳动物细胞中，越来越多的研究发现，Denovo合成通路在不同器官参与调控多种生物学过程，90％的游离色氨酸通过Denovo合成通路途径代谢。色氨酸分别经过吲哚-2，3-二恶英酶1(indole-2，3-dioxygenase1，IDO1)及喹啉酸磷酸核糖基转移酶(quinolinatephosphoribosyltransferase，QPRT)这两个关键的限速酶代谢后产生NAD+。然而Denovo合成通路在卵巢中对NAD+水平的维持作用目前尚无相关报道。<br>　　目的<br>　　本课题旨在研究NAD+Denovo合成通路在卵巢衰老过程中对NAD+水平的调控作用，明确NAD+调控卵巢衰老的分子机制，为NAD+的临床应用提供可靠的理论依据。<br>　　方法<br>　　1.通过对小鼠卵巢切片进行免疫荧光染色明确IDO1及QPRT的表达定位;应用CRISPR-Cas9系统建立Ido1及Qprt基因敲除小鼠品系并繁育。通过Sanger测序和蛋白质印迹法(WesternBlot)验证敲除效率。<br>　　2.检测卵巢内Ido1及Qprt转录水平及NAD+含量随年龄的变化。<br>　　3.将Ido1-/-，Qprt-/-及野生型雌鼠分别与野生型雄鼠合笼并记录产仔数。计数各组小鼠不同月龄时期的各级卵泡数量，比较各组小鼠生育力和卵巢储备变化。采用WesternBlot及定量逆转录PCR(quantitativereversetranscriptionPCR，RT-qPCR)技术评估各组小鼠卵巢线粒体功能;观察卵母细胞形态，利用免疫荧光染色比较不同组间卵母细胞质量及其线粒体变化。<br>　　4.Ido1-/-和Qprt-/-小鼠补充NAD+前体物质烟酰胺核糖(nicotinamideriboside，NR)，将Ido1-/-、Qprt-/-及补充NR后的雌鼠分别与野生型雄鼠合笼并记录产仔数、计数各组小鼠不同月龄时期的各级卵泡数量、观察卵母细胞形态、利用免疫荧光染色比较不同组间卵母细胞质量及其线粒体变化。<br>　　5.Ido1-/-和Qprt-/-及野生型12月龄小鼠的卵巢进行转录组测序分析。<br>　　6.实验结果采用PRISM5统计软件包进行分析，数值型变量采用均数士标准误(mean±SEM)表示，分类变量采用百分比表示。统计分析两组间比较采用独立样本t检验，多重分析选用单因素方差分析(OneWayANOVA)，组间比较采用Tukey法，率的比较采用卡方检验(Chi-squaretest)。P＜0.05认为差异显著。<br>　　结果<br>　　1.Ido1及Qprt敲除加速了小鼠卵巢NAD+水平、生育能力、卵巢储备及功能的年龄相关性下降。<br>　　2.Ido1及Qprt敲除导致小鼠卵泡发育障碍、颗粒细胞凋亡增多。<br>　　3.Ido1及Qprt敲除导致小鼠卵母细胞线粒体功能异常、卵母细胞受精及胚胎发育潜能下降。<br>　　4.补充NR可提高Ido1-/-和Qprt-/-小鼠卵巢内NAD+含量、改善卵母细胞质量，延缓卵巢衰老。<br>　　结论<br>　　1.NAD+Denovo合成通路参与卵巢内NAD+含量的维持。<br>　　2.Ido1及Qprt敲除导致线粒体功能障碍、卵巢储备及卵母细胞质量下降，小鼠生育力降低，卵巢衰老加速。<br>　　3.补充NR提高卵巢NAD+含量可延缓Ido1及跏力敲除所致的卵巢储备及卵母细胞质量下降，提高其生育力。