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摘要结直肠癌(Colorectalcancer,CRC)的发生发展是一系列遗传和表观遗传突变的结果，我国结直肠癌的发病率和死亡率每年都在不断增加。结直肠癌患者的癌细胞中的表皮生长因子受体（Epidermalgrowthfactor,EGFR）和PD-L1（Programmedcelldeath-ligand1）异常表达通常与不良预后相关。PSP(Polysaccharopeptide)是云芝(Trametesversicolor)中主要的活性成分。有研究报道表明PSP除了自身具有良好的抗肿瘤活性之外，还能直接或者间接地刺激免疫系统。但PSP具体的抗肿瘤作用机制仍不清楚，且有关PSP对结直肠癌的影响及其分子作用机制的研究还较少。<br>　　本论文的研究工作中，我们首先探讨了PSP对结直肠癌的抑制作用，并解释了其发挥作用可能影响的信号通路。其次，利用大肠杆菌和毕赤酵母两个表达体系，诱导重组表达了云芝中的小分子活性蛋白Musarin。<br>　　第一部分工作中，我们主要探讨了PSP对结直肠癌的抑制作用及其具体分子作用机制。通过MTT实验，发现PSP能够显著抑制结直肠癌细胞的增殖。利用RT-qPCR、Westernblot和免疫荧光的方法，检测经PSP处理过的结直肠癌细胞中EGFR、PD-L1及其相关信号通路关键分子的表达情况。实验结果表明，PSP能够显著地降低结直肠癌细胞中EGFR和PD-L1的表达。并且，PD-L1和EGFR信号通路的下游关键分子p-EGFR、STAT3、p-STAT3和c-Jun也都受到了不同程度抑制。TUNEL(原位末端标记法，Terminal-deoxynucleoitidyltransferasemediatednickendlabeling)实验结果表明，PSP能恢复肿瘤细胞的免疫原性，使PBMC（外周血单个核细胞，Peripheralbloodmononuclearcell）能够重新识别并杀伤肿瘤细胞。研究结果提示我们，PSP既可以通过抑制结直肠癌细胞中EGFR的表达及其磷酸化来抑制肿瘤细胞的增殖，同时也能通过下调结直肠癌细胞PD-LI的表达来增强免疫细胞对结直肠癌细胞的识别和杀伤作用。<br>　　第二部分工作主要针对本课题组前期从云芝中分离纯化获得的分子量约为的12kDa的小分子活性蛋白，并将其命名为Musarin。解析了其结构和序列，初步阐明了其抑制结肠癌作用的机制。但由于从云芝糖肽中纯化得到Musarin的工艺复杂且得率低，成本过于高昂。因此我们尝试通过蛋白质重组表达的方式，以期建立获得Musarin相对简单的方法，同时提高目标产物的得率。我们以Musarin基因序列为模板，利用pET-28a(+)载体和pPIC9K载体构建重组表达质粒，分别在BL21(DE3)大肠杆菌(Escherichiacoli)，GS115和KM71毕赤酵母(PichiaPastoris)表达体系中成功表达了重组蛋白Musarin。<br>　　综上所述，我们报道了PSP能够显著性地抑制结直肠癌细胞中EGFR和PD-L1的表达。其可能的作用机制是通过抑制其下游信号通路中的关键信号分子p-EGFR(Try1068)、c-Jun、STAT3和p-STAT3(Try705)，来实现对结直肠癌的增殖抑制和降低CRC中PD-L1的持续性表达。一方面通过降低结直肠癌细胞中EGFR的表达及其磷酸化来发挥对结直肠癌细胞增殖的抑制作用;另一方面通过抑制PD-L1的持续性表达来增强免疫细胞对结直肠癌细胞的识别和杀伤作用。Musarin是本课题组前期从云芝中分离得到的小分子糖肽，因此我们想通过体外重组表达的方式获得更多目标产物。以Musarin的DNA序列为模板，成功利用pET-28a(+)和pPIC9K表达载体构建重组质粒。在大肠杆菌BL21(DE3)菌株和毕赤酵母GS115和KM71菌株中成功表达了Musarin。