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摘要神经退行性疾病是指由于中枢神经元发生退行性病变而导致的疾病，目前常见的神经退行性疾病有阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease，AD)、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)、亨廷顿病(Huntington’s disease，HD)等。这类疾病形成过程中均伴随着蛋白质的错误折叠，但是其真正的病因还是未知。基于MRI技术对AD患者脑组织检测，发现在淀粉样蛋白沉积处有铁离子的积累。铁离子是生物体所必需的微量金属元素，在机体中参与了许多重要的代谢过程。尽管机体对铁离子的代谢有严格的精细调控，但是遗传、年龄和环境等因素的变化会导致铁离子代谢紊乱，最终导致铁离子在机体中的积累进而引发许多老年性疾病如AD、PD等。铁离子在AD患者脑组织中的积累会诱发氧化应激进而导致氧化胁迫最终会引发神经元的死亡。神经元的死亡会进一步影响人体认知、记忆和运动等正常功能。因此，深入探究铁稳态失衡在AD病变中的分子变化对解析这一人类顽疾病因至关重要，有望为该病提供新的治疗措施和靶位。根据文献调研，我们发现黑豆皮提取物中含有丰富的多酚类物质，如花青素物质，该物质中氰基3-葡萄糖苷(C3G)含量最多，并且这种物质能够穿过血脑屏障。花青素物质具有很好的抗氧化特性，另外还发现其在机体中还具有调节铁离子平衡的特性。鉴于花青素物质具有的这些特性，我们利用AD疾病模型果蝇探究了黑豆皮提取物是否可以改善AD症状以及其内在的生物学机制，希望以此为AD疾病的预防和治疗提供新的线索。在我们的实验中均采用标准玉米培养基和添加0.5％黑豆皮提取物(Black bean coat extracts，BBCE)的玉米培养基培养野生型果蝇和疾病模型果蝇。取得的主要研究成果如下:<br>　　1)添加黑豆皮提取物可以显著改善AD疾病果蝇症状。在果蝇寿命实验中我们发现喂食添加黑豆皮提取物的食物可以显著的延长Aβ42果蝇的寿命，其半数寿命延长率为37.9％;在培养5日龄到25日龄期间的行为能力检测，发现添加黑豆皮提取物可以显著改善Aβ42果蝇的爬行能力;在培养10日龄对果蝇的认知能力检测，发现添加黑豆皮提取物显著改善了Aβ42果蝇的嗅觉记忆能力，而且其效果比阳性对照药物美金刚(Memantine，MEM)更加显著;对培养10日龄和培养25日龄的果蝇进行脑组织切片HE染色实验，发现添加黑豆皮提取物可以显著减少果蝇脑组织中的空泡数;对培养5日龄果蝇复眼表型观察发现，添加黑豆皮提取物能够显著减少AD果蝇复眼坏死的数量和复眼坏死面积的大小。<br>　　2)添加黑豆皮提取物显著逆转了致病蛋白Aβ42对果蝇脑组织和身体部分金属离子稳态的不利影响。利用ICP-MS技术通过对培养果蝇10日龄和25日龄的脑组织和身体部分金属微量元素水平检测发现，与对照正常果蝇相比随着日龄增加特异过表达Aβ42果蝇脑组织的铁、锌离子水平呈显著增加趋势，铜离子有增加的趋势，锰离子显著减少，添加黑豆皮提取物显著降低了铁、锌离子增加的水平，在早期延缓了锰离子降低的趋势;在果蝇脑神经系统特异过表达Aβ42，果蝇身体部分锌、铜、锰水平呈降低的趋势，添加黑豆皮提取物显著提高了身体部分锌、铜、锰的水平，在早期抑制了铁水平的增加。以上结果表明黑豆皮提取物具有平衡AD致病蛋白Aβ42导致的果蝇脑组织和身体部分金属离子代谢紊乱的功能，特别是对于铁离子和锌离子。在添加黑豆皮提取物的玉米培养基培养10日龄对果蝇肠道进行分离和普鲁士蓝染色实验，发现肠道中储铁区域的面积的大小也发生了显著的变化，显著提高了野生型果蝇肠道组织中铁离子的含量。通过顺乌头酸酶活性检测发现添加黑豆皮提取物的玉米培养基培养25日龄的果蝇脑显著降低了顺乌头酸酶的活性。顺乌头酸酶活性的高低反映了游离铁离子含量的多少，即减少了游离铁离子的含量。综合以上结果表明黑豆皮提取物具有调控金属离子稳态平衡的功能，特别是对于铁离子，可能通过调节减少游离铁离子的含量来改善AD症状。<br>　　3)黑豆皮提取物通过调控与铁代谢相关基因的表达实现对果蝇脑组织和身体铁水平的平衡。我们利用RNA-Seq技术研究黑豆皮提取物对疾病模型果蝇脑组织和身体部分基因表达上调及下调基因数量的影响以及黑豆皮提取物对与铁离子代谢相关基因表达量的影响，利用qPCR技术检测与铁离子代谢相关的基因的表达水平，发现添加黑豆皮提取物可以显著影响果蝇铁代谢关键基因的表达，特别是对于培养10日龄的Aβ42果蝇，在果蝇脑组织显著降低了储铁蛋白Ferritin的轻链Fer2LCH的转录水平，显著提高了脑组织多铜亚铁氧化酶MCO1的转录水平，在果蝇身体部分对MCO1的转录水平没有显著的影响，显著提高了Ferritin和Transferrin2的转录水平。通过以上RNA-Seq及qPCR的结果表明添加黑豆皮提取物可以调节与果蝇机体中铁离子代谢相关基因的表达水平，通过相关关键蛋白的协调表达来抑制铁离子在AD果蝇脑组织中的累积，减轻Aβ42表达引起的铁累积不利影响。<br>　　4)添加黑豆皮提取物可显著减少Aβ42果蝇脑组织氧化胁迫。通过qRT-PCR发现，添加黑豆皮提取物使10日龄野生型果蝇脑组织中SOD1基因的表达水平显著提高，但对于25日龄果蝇脑组织中SOD1基因的表达水平均没有显著的变化;对于身体部分，添加黑豆皮显著降低正常果蝇SOD1水平，并且明显抑制了Aβ42果蝇SOD1水平上升的趋势。由于SOD1可以反映生物体内氧化胁迫状态，说明添加黑豆皮提取物可以显著缓解果蝇体内的氧化胁迫。通过DCFH试剂盒检测果蝇脑组织和身体部分的ROS含量发现，对于10日龄果蝇，添加黑豆皮提取物对正常果蝇脑组织ROS水平无显著影响，但对Aβ42果蝇脑组织ROS有降低的趋势，对于身体部分，添加黑豆皮提取物对均显著降低了正常果蝇和Aβ42果蝇的ROS水平。利用果蝇脑组织石蜡切片HE染色，结果显示添加黑豆皮提取物对于野生型果蝇的脑组织中ROS的含量没有显著的影响，但是显著降低了Aβ42果蝇脑组织中ROS的含量。以上结果表明，黑豆皮提取物也可能通过抗氧化途径减少ROS积累来改善AD症状。<br>　　综上，本研究揭示了添加黑豆皮提取物可以显著改善AD疾病模型果蝇的行为、认知等方面缺陷，其中的机制可能是黑豆皮提取物通过调控金属代谢相关关键基因的表达，一定程度逆转了AD致病蛋白Aβ42对果蝇脑神经系统乃至身体部分金属离子稳态的破坏，从而延缓了AD疾病果蝇的发病进程。由于金属稳态失衡，特别是铁稳态失衡会引起严重氧化胁迫，本研究实验证实了添加黑豆皮提取物可显著降低Aβ42果蝇脑组织的铁累积和自由铁离子水平，从而也降低了其ROS水平，提高了果蝇脑以及全身的抗氧化胁迫能力。此外，本研究通过RNA-Seq技术对黑豆皮提取物的调控网络进行了解析，发现添加黑豆皮提取物可以影响与金属铁离子和抗氧化相关基因的表达水平。以上结果为AD疾病的有效预防和干预提供了新的手段和途径，具有重要科学意义和应用价值。