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摘要研究目的:<br>　　盐诱导激酶1(saltinduciblekinase1，SIK1)是AMP活化蛋白激酶相关激酶(AMP-activatedproteinkinaserelativekinase，AMPKRK)家族成员之一，调控多种机体代谢相关生理活动。然而，SIK1对肝脏和骨骼肌糖代谢的调控还存在很多未知之处，同时，能够激活SIK1的小分子化合物也鲜有报道。本实验室前期研究发现，天然产物phangininA具有肝糖异生抑制作用，该作用与phangininA激活SIK1进而激活PDE4终止cAMP/PKA/CREB信号通路相关;同时，phangininA长期口服给药后对2型糖尿病ob/ob小鼠也具有较好的治疗作用。因此，phangininA是本实验室首次报道的可激活SIK1的小分子化合物，同时也是一个具有开发潜力的抗2型糖尿病活性先导化合物。<br>　　本论文的第一部分将对化学合作课题组合成的phangininA衍生物Fwo-143抑制肝糖异生的作用进行系统研究，明确Fwo-143对SIK1的激动活性及其与肝糖异生抑制作用的相关性，并考察Fwo-143对2型糖尿病小鼠的降糖作用，评价Fwo-143作为抗2型糖尿病新药候选化合物的发展潜力。本论文的第二部分将以phangininA为探针，研究SIK1激活对骨骼肌细胞葡萄糖摄取的调控作用及其分子机制，为深入理解SIK1在骨骼肌能量代谢调控中的作用提供新的线索和依据。<br>　　研究方法:<br>　　采用原代培养小鼠肝细胞模型，评价Fwo-143对肝糖异生的调控作用。采用ELISA试剂盒检测Fwo-143对细胞环磷腺苷(cyclicadenosinemonophosphate，AMP)含量的影响。采用免疫印迹法检测环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-responseelementbindingprotein，CREB)和SIK1的磷酸化水平。采用SIK广谱抑制剂研究SIK1激活与Fwo-143抑制糖异生的相关性。在2型糖尿病ob/ob小鼠模型上评价Fwo-143长期口服给药后的治疗作用，并采用免疫印迹法分析Fwo-143长期给药后对ob/ob小鼠肝脏SIK1和CREB磷酸化的作用。<br>　　采用C2C12小鼠肌管细胞研究phangininA对骨骼肌葡萄糖摄取的调控作用。采用real-timeqPCR检测phangininA对骨骼肌组织或细胞中葡萄糖转运蛋白4(glucosetransporter4，GLUT4)、肌细胞增强因子2a(myocyteenhancerfactor2a，MEF2a)和片珠蛋白(junctionplakoglobin，JUP)mRNA表达的调控作用。采用免疫印迹法分析phangininA对C2C12细胞SIK1、组蛋白去乙酰化酶4/5/7(histonedeacetylase4/5/7，HDAC4/5/7)、蛋白激酶B(proteinkinaseB，PKB/Akt)和160kDa的Akt底物(Aktsubstrateof160kDa，AS160)磷酸化以及对GLUT4的总蛋白水平及膜上蛋白水平的调控作用。采用SIK广谱抑制剂和siRNA介导的SIK1干扰技术研究SIK1激活与phangininA促进C2C12细胞葡萄糖摄取的相关性。采用肝脏激酶Bl(liverkinaseB1，LKB1)干扰技术探索phangininA激活SIK1及其促进葡萄糖摄取作用与LKB1的相关性。采用P13K抑制剂和Akt抑制剂探索P13K/Akt信号通路激活与phangininA促进骨骼肌细胞葡萄糖摄取的相关性。采用JUP干扰技术探索phangininA激活Akt及其促进骨骼肌细胞葡萄糖摄取与JUP的相关性。观察C57BL/6J小鼠长期口服给与phangininA后骨骼肌组织中SIK1激活及对骨骼肌糖代谢和利用的调控作用。<br>　　研究结果:<br>　　PhangininA衍生物Fwo-143能够显著抑制小鼠原代肝细胞糖异生，促进肝细胞SIK1的磷酸化，降低细胞内cAMP水平，抑制CREB磷酸化。SIK抑制剂HG-9-91-01可逆转Fwo-143对小鼠原代肝细胞糖异生的抑制作用。2型糖尿病ob/ob小鼠经Fwo-143长期给药处理后，肝脏SIK1磷酸化水平显著上调，CREB磷酸化水平显著下调，且ob/ob小鼠的随机血糖和空腹血糖均明显下降，提示Fwo-143对2型糖尿病ob/ob小鼠具有显著治疗作用。<br>　　PhangininA能够显著促进C2C12小鼠肌管细胞葡萄糖摄取，并可同时增加细胞内GLUT4的表达和促进细胞内GLUT4的上膜。PhangininA可显著增加C2C12小鼠肌管细胞SIK1蛋白磷酸化水平，同时，SIK广谱抑制剂HG-9-91-01和干扰SIK1均可阻断phangininA对C2C12小鼠肌管细胞葡萄糖摄取的促进作用。干扰C2C12小鼠肌管细胞内LKB1的表达可阻断phangininA对SIK1的激活作用，同时，phangininA促进葡萄糖摄取作用也被阻断。PhangininA能够促进C2C12小鼠肌管细胞HDAC4/5/7磷酸化并进而增加MEF2a和GLUT4表达，该作用可被SIK1干扰完全阻断。PhangininA能够促进C2C12小鼠肌管细胞JUP的表达，进而激活Akt/AS160信号通路;PI3K及Akt抑制剂能够逆转phangininA对葡萄糖摄取的促进作用;干扰JUP能够阻断phangininA对Akt/AS160磷酸化和葡萄糖摄取的促进作用;且干扰SIK1也可阻断phangininA对JUP表达和Akt/AS160磷酸化的促进作用。PhangininA长期口服给药后可显著增加C57BL/6J小鼠骨骼肌组织中SIK1和HDAC4/5/7的磷酸化水平，并增加MEF2a、GLUT4和JUP表达，激活Akt/AS160信号通路，促进GLUT4转位上膜，并可显著增加骨骼肌组织中糖原合成和糖酵解基因的表达。<br>　　研究结论:<br>　　本论文研究发现，phangininA衍生物Fwo-143能够显著增加原代小鼠肝细胞SIK1磷酸化，抑制cAMP/CREB信号通路，并进而抑制原代小鼠肝细胞糖异生功能。Fwo-143对2型糖尿病ob/ob小鼠具有良好的治疗作用，具备成为抗2型糖尿病新药候选化合物的潜力。<br>　　本论文研究还发现，phangininA促进C2C12小鼠肌管细胞葡萄糖摄取与其激活SIK1相关。SIK1激活后可通过磷酸化HDAC4/5促进MEF2a的表达，并进而促进细胞内GLUT4的表达;同时，SIK1激活后还可通过磷酸化HDAC7促进JUP的表达，激活Akt/AS160信号通路，并进而促进GLUT4转位上膜。本论文以phangininA为探针，初步阐明了SIK1激活后可通过增加GLUT4蛋白表达和促进GLUT4上膜的双重机制发挥对C2C12小鼠肌管细胞葡萄糖摄取的促进作用，为深入理解SIK1参与调控骨骼肌葡萄糖摄取提供了新的线索和实验依据。