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摘要研究背景:蛋白质的泛素化(ubiquitination)修饰是一种重要的翻译后修饰，参与多种细胞生物学活动。泛素是一种小分子蛋白质，能够以单个或以聚合链的形式结合在底物蛋白上进行修饰，由此泛素化修饰可以分为单泛素化修饰和多泛素化修饰。泛素化修饰是一个复杂的过程，由泛素活化酶ubiquitin-activatingenzymes，E1)、泛素结合酶(ubiquitin-conjugatingenzyme，E2)、泛素连接酶(ubiquitinligase，E3)级联催化泛素分子共价结合在底物分子上以调节蛋白质功能。泛素有7个赖氨酸(Lys)残基(Lys6，Lys11，Lys27，Lys29，Lys33，Lys48和Lys63)，之前的研究发现泛素化修饰是通过这的7个Lys残基之一产生的，近年来发现了一种新的泛素化修饰是通过泛素N末端的甲硫氨酸(Met)残基形成的，称为线性泛素化修饰(1inearubiquitinmodification)。线性泛素链组装复合体(1inearubiquitinationassemblycomplex，LUBAC)是迄今为止唯一己知的可以催化线性泛素化的泛素连接酶，由催化亚基HOIP和两个调节亚基SHARPIN、HOIL-1L所组成。目前的研究发现线性泛素化修饰在核因子-κb(NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)的激活，选择性自噬，巨噬细胞的炎症小体激活，干扰素信号等有关先天和适应性免疫中发挥重要作用，LUBAC中任何一个亚基的功能缺失会在小鼠模型或人类身上引起炎症、免疫缺陷甚至胚胎死亡。线性泛素化修饰具有重要的生物学功能，但目前鉴定到的底物不多，本研究以线性泛素链组装复合体UJBAC为切入点，通过研究HOIP互作蛋白的方式探寻新的线性泛素化修饰底物，进一步研究其生物学功能。<br>　　研究目的:验证RabGEFl(Rabguaninenucleotideexchangefactor1)为线性泛素化修饰的新底物。<br>　　研究方法:通过BioGRID数据库筛选，从中选取了LUBAC的催化中心HOIP的相互作用蛋白——RabGEF1蛋白。通过PCR技术，扩增得到RabGEF1基因片段，经EcoRI和BamHI两种限制性核酸内切酶酶切，得到具有相同酶切位点的RabGEF1基因片段和pEF6/Myc-HisC载体，通过无缝连接体系，在pEF6/Myc-HisC载体中插入了人RabGEF1基因片段，构建了pEF6/Myc-RabGEFl质粒，方便后续实验。通过免疫共沉淀实验(Co-IP)验证RabGEFl和HOIP的相互作用。利用GST-pulldown实验探索RabGEF1与HOIP相互作用结构域。通过免疫荧光实验验证毗LbGEFl和HOIP的相互作用与亚细胞定位。应用体内泛素化实验检测RabGEFl的线性泛素化修饰。将RabGEFl的泛素化蛋白样品进行质谱分析，根据质谱结果提示的RabGEF1泛素化位点构建RabGEF1泛素化赖氨酸位点突变质粒，利用RabGEF1点突变质粒在体内泛素化实验中验证RabGEFl的泛素化修饰位点。<br>　　研究结果:我们发现RabGEF1与HOIP存在相互作用，且HOIP通过ZF-NEF结构域与RabGEF1发生直接相互作用。RabGEF1与HOIP共同定位于细胞质。LUBAC介导RabGEFl发生线性泛素化修饰依赖于LUBAC酶活性，nbGEF1泛素化修饰位点为K158。<br>　　研究结论:RabGEF1为线性泛素化修饰的新底物，且K158是其发生线性泛素化修饰的位点。