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摘要炎症是人体的一种天然防御反应，在保护组织免受损伤和感染方面发挥着至关重要的作用。然而，炎症若不能及时消退会对组织器官造成损害，并发展成炎症性疾病，例如心肌缺血再灌注损伤(myocardialischemiaandreperfusioninjury，MIRI)、腹主动脉瘤(abdominalaorticaneurysm，AAA)、炎症性肠病、类风湿性关节炎等。近年来，生物大分子药物(例如蛋白质、核酸药物)发展迅猛，与传统的小分子抗炎药物(例如非甾体类抗炎药、糖皮质激素)相比，其具有药理活性高、特异性强、毒副作用小等优点，为炎症性疾病的治疗带来了新希望。然而，大分子药物普遍存在体内易降解、生物膜穿透性差、病灶靶向性不佳等缺陷，使其治疗功效受到了严重限制。近年来，基于纳米材料的大分子药物递送系统获得了蓬勃发展，其可延长药物的体内半衰期、提升生物膜穿透效率、提高药物的生物利用度。然而，大分子纳米递送系统仍面临许多挑战。一方面，体内存在多重生理屏障，严重阻碍了纳米药物在病灶组织富集、渗透以及被靶细胞摄取，现有的大分子纳米递送系统较难同时克服体内的多重生理屏障;另一方面，炎症性疾病存在复杂的免疫调节机制及炎症因子网络，针对单一靶点的治疗策略往往无法达到预期的治疗功效。<br>　　针对上述关键科学问题，本文设计和制备了多种大分子药物纳米递送系统，用于克服大分子药物体内递送面临的多重生理屏障并多维度调控炎症病理微环境，进而缓解过度的炎性反应、治疗炎症性疾病。首先，针对细胞层面的转染屏障，设计了穿膜活性强的球形α螺旋阳离子聚多肽，实现了小干扰RNA(smallinterferenceRNA，siRNA)在心肌细胞中的高效跨膜递送，并经心肌局部注射给药调控MIRI后的炎症反应。接着，为了提升阳离子基因载体的血液稳定性并用于静脉给药，设计了循环稳定、炎症靶向和活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)超敏响应的药物/siRNA共递送体系，用于协同调控MIRI后中性粒细胞的招募与浸润，高效抑制心肌组织的炎症反应。随后，为了进一步提升siRNA递送载体在病灶组织(炎性血管中膜层)中的渗透能力，设计了氟化修饰的纳米囊，用于AAA中血管平滑肌细胞(VSMCs)的siRNA靶向递送。最后，考虑到炎症环境中复杂的免疫调节和炎症因子网络，设计了基于巨噬细胞膜的仿生纳米诱饵，用于促炎因子受体、共刺激分子(PD-L1)等膜蛋白的炎症靶向递送，用于清除多种促炎因子和PD-1，进而调控炎症反应和CD4+T细胞活性，实现自身免疫性疾病的多靶点抗炎治疗和免疫调节。<br>　　本论文的主要研究内容如下:<br>　　第一章对炎症性疾病进行了概述，介绍炎症性疾病的治疗方案，阻碍药物递送的生理屏障、纳米药物递送载体的种类、设计、功能化改性策略和体内外抗炎作用。<br>　　为了实现siRNA的高效胞内递送和溶酶体逃逸，第二章以第三代树状大分子为引发剂，通过γ-(4-炔丙氧基苄基)-L-谷氨酸-N-羧基酸酐的开环聚合和侧链胍基修饰，构建了球形α螺旋阳离子穿膜聚多肽(DPP)。与线性α螺旋聚多肽(LPP)相比，DPP具备更强的核酸结合能力和穿膜活性，这主要是由于DPP具有多价态结构以及更高的电荷密度。因此，DPP可与E2F1siRNA(siE2F1)通过静电吸附作用形成稳定的纳米复合物，显著提升心肌细胞的摄取和内涵体/溶酶体逃逸，其在心肌细胞中的E2F1基因沉默效率(72.8％)显著高于LPP(50.9％)及商业化转染试剂25kPEI(39.3％)。E2F1表达下调显著降低了心肌细胞内ROS水平，进而抑制氧化应激导致的细胞凋亡。MIRI大鼠心肌原位注射DPP/siE2F1纳米复合物后，心肌组织中E2F1的基因沉默效率可达67.4％，促炎因子IL-6和TNF-α表达均显著降低。同时，MIRI大鼠的心功能得到有效恢复，心肌组织损伤程度显著下降，心肌梗死面积、心脏纤维化面积和心肌细胞凋亡率分别降至13.6％、12.3％、12.8％。<br>　　由于阳离子载体血液稳定性差，易被网状内皮细胞清除，无法用于静脉注射给药，且缺乏病灶靶向性。针对该问题，第三章设计了炎症内皮细胞靶向、ROS超敏响应的阳离子聚合物(RPPT)用于递送VCAM-1siRNA(siVCAM-1)。首先，通过联碲连接键交联低分子量聚乙烯亚胺(PEI)并依次修饰聚乙二醇(PEG)及cRGD，制备了ROS可降解、炎症内皮细胞靶向的RPPT。通过静电吸附作用将RPPT包覆在载有地塞米松(DXM)的聚(乳酸-羟基乙酸)(poly(1actic-co-glycolicacid)，PLGA)纳米粒表面，并进一步通过静电吸附作用包载siVCAM-1，构建了共载siVCAM-1和DXM的纳米复合物。由于联碲基团的ROS超敏响应性，RPPT经低浓度H2O2(100μM)处理后，可以有效降解成低分子量片段并促进siRNA释放。PEG可以抵抗血清蛋白吸附，而cRGD可以与炎症内皮细胞表面过表达的整合素αvβ3结合，因此纳米复合物静脉注射后可在血液中长循环并主动靶向富集至MIRI受损心脏。进入炎症内皮细胞后，胞内ROS触发RPPT降解并释放siVCAM-1，下调VCAM-1表达，进而抑制中性粒细胞粘附至血管内皮;同时，DXM抑制内皮细胞释放促炎因子TNF-α，进而减少中性粒细胞向受损心脏迁移。最终，在siVCAM-1与DXM的协同作用下，中性粒细胞在受损心肌中的比例显著下降(2.9％)，且低于单独递送siVCAM-1(11.3％)及DXM(4.4％)。此外，经纳米复合物治疗后，MIRI大鼠心功能几乎恢复至正常水平，心肌梗死面积、心肌纤维化和心肌细胞凋亡率分别下降了82.0％、75.1％、72.7％。<br>　　致密的细胞外基质(ECM)是纳米药物向组织深处渗透的主要障碍，例如在AAA病灶血管中膜层中，异常沉积的ECM严重阻碍了纳米药物在中膜层中的渗透，进而降低了中膜层中VSMCs对纳米药物的有效摄取。为了克服这一组织渗透屏障，第四章设计了一种还原响应、病变血管靶向、可高效渗透血管中膜层的小尺寸氟化聚合物纳米囊，用于包载和系统递送ALDH2siRNA(siALDH2)，促进VSMCs表型转换，调控血管壁炎性环境，实现AAA的抗炎治疗。通过多种单体在siALDH2表面原位自由基聚合形成网状聚合物外壳，从而有效包载siALDH2，形成了小尺寸(～20nm)、表面正电荷较低(～12mV)的氟化纳米囊(PFSsANCs)。静脉注射后，PEG帮助纳米囊有效避免血清蛋白吸附，从而实现在血液中长循环。随后，纳米囊通过Ⅳ型胶原靶向肽主动识别受损血管处暴露的Ⅳ型胶原并高效富集至AAA病灶血管处。氟烷烃链的疏水疏油特性使得PFSsANCs有效防止ECM中多种蛋白及多糖的粘附，而小尺寸有助于纳米囊在ECM中扩散，因此PFSsANCs可以高效渗透血管中膜层，其渗透深度可达75μm，而未经氟化的纳米囊(PNSsANCs)只能停留在血管内壁表面。进入VSMCs后，PFSsANCs经还原触发解离，释放siALDH2，从而沉默ALDH2表达，通过ALDH2-MAX.Myocardin通路上调α-SMA及SM22α表达，使得VSMCs向收缩表型转换，进而降低细胞表面趋化因子受体的表达，减少炎症细胞的浸润，最终降低炎症反应及其导致的血管组织损伤。在氯化钙诱导的AAA大鼠模型中，经PFSsANCs治疗后，AAA大鼠的血管直径增长率为118.3％，明显低于PBS组(152.6％)、PNSsANCs组(135.2％)以及FSsANCs组(氟化但不含靶向，140.4％)。此外，血管内侧弹性纤维受损程度、血管壁钙化程度以及血管壁完整性均得到了显著改善。<br>　　由于炎症反应涉及复杂的免疫调节机制和多种促炎因子，针对单一靶点的抗炎治疗往往效果不尽如人意。针对该问题，第五章设计了基于巨噬细胞膜的仿生纳米粒，用于PD-L1及多种促炎因子受体等膜蛋白的靶向递送，实现自身免疫性疾病中炎症级联反应的多靶点阻断。首先，利用IFN-γ处理RAW264.7细胞获得高表达PD-L1、促炎因子受体及粘附分子受体的巨噬细胞膜(PRM)。随后，通过超声法将PRM包覆于PLGA纳米粒表面，构建纳米诱饵(PRMNDs)。细胞膜包覆帮助PRMNDs伪装成内源性细胞，因此，静脉给药后，PRMNDs可以有效逃避网状内皮系统的捕获，从而实现体内长循环(半衰期长达12.04小时)。表面高表达粘附分子受体的PRMNDs通过与炎症细胞表面过表达的细胞间粘附分子相结合，高效靶向炎症组织。随后，PRMNDs通过高效清除多种游离的促炎因子(TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ)抑制了促炎因子导致的细胞活化，并通过清除游离的PD-1(sPD-1)或结合CD4+T细胞表面的PD-1(mPD-1)有效抑制了CD4+T细胞的活化，从而恢复免疫耐受。在ZymosanA诱导的关节炎小鼠模型中，PRMNDs治疗使得小鼠膝关节肿胀明显消退，显著降低了促炎型CD4+T细胞(Th1和Th17)的比例，抑制了骨关节中骨质流失、骨结构破坏、炎症细胞浸润，最终有效恢复了小鼠的运动功能。在葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型中，PRMNDs治疗有效抑制了小鼠结肠缩短及体重下降，并且维持了肠上皮组织的完整性。更重要的是，在上述两个动物模型中，PRMNDs的抗炎和免疫抑制功效均优于TNF-α单克隆抗体，表明PRMNDs在炎症性疾病的治疗中具有良好的应用前景。<br>　　第六章总结了本论文的工作，并对未来的研究方向进行了展望。<br>　　综上所述，本论文根据生物体内存在的多重生理屏障，设计了一系列大分子药物递送系统用于提升核酸及蛋白药物的递送效率，为大分子药物递送载体的合理设计提供了一定的参考意见。同时，结合炎症性疾病复杂的免疫调节机制及炎症因子网络，本研究还探索了多靶点治疗在炎症性疾病治疗领域中的应用，为炎症性疾病的治疗策略提供了新思路。