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摘要研究背景和意义:<br>　　肥胖及其引发的代谢类疾病已经成为严重危害人类健康的危险因素，因此，理解肥胖发生过程中的分子机制对治疗和预防肥胖及其代谢类疾病具有十分重大的意义。近年来研究表明，在肥胖发生过程中，脂肪组织主要通过脂肪细胞新生和脂肪细胞肥大两种方式实现组织扩张，转录因子、信号通路和内分泌激素在其中起着至关重要的作用，如转录因子CCAAT增强子结合蛋白α(CCAATenhancerbindingproteina,C/EBPα),过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisomeproliferator-activatedreceptorγ,PPARγ),信号通路TGF-β、Wnt信号等。<br>　　Sema7A是轴突导向分子家族成员之一，研究报道其在神经轴突生长、骨形成、血管新生、肿瘤转移以及免疫调节等多种病理和生理过程发挥重要作用。本课题组2018年首次报道了在扰动流条件下，内皮细胞Sema7A上调，通过作用于受体Itgb1(整合素β1)，增强内皮细胞黏附分子表达，促进炎症细胞的浸润，进而参与动脉粥样硬化的发生发展。在本课题组近期研究中，利用高脂饮食诱导的小鼠肥胖模型，发现Sema7A敲除会加重小鼠肥胖、降低胰岛素敏感性和葡萄糖耐受，但是分子机制尚未明确。因此，本论文将探究Sema7A参与肥胖发生的细胞与分子机制，为肥胖及其引发的代谢性疾病提供新的潜在诊断和治疗靶点。<br>　　研究目的:<br>　　本研究旨在探究Sema7A在脂肪细胞分化和脂质合成中的作用及其分子机制，并且利用Sema7A重组蛋白探究其对高脂饮食诱导的小鼠肥胖的保护作用，为Sema7A临床药物开发奠定理论基础。<br>　　研究方法:<br>　　1.小鼠脂肪间充质干细胞的分离和成脂分化<br>　　在无菌条件下，取4-6周龄野生型（Widetype,C57BL/6J背景）小鼠的内脏脂肪组织和皮下脂肪组织，将其剪碎并在消化酶作用下获得内脏脂肪组织来源的间充质干细胞(Visceraladipose-derivedmesenchymalstemcells,V-ADSC)和皮下脂肪组织来源的间充质干细胞(Subcutaneousadipose-derivedmesenchymalstemcells,S-ADSC)。然后，在培养基中添加刺激诱导物，分别诱导内脏和皮下脂肪间充质干细胞成脂分化，通过q-PCR检测成脂分化过程中Sema7A及其受体的表达变化。<br>　　2.Sema7A对脂肪细胞分化的影响<br>　　(1)分别从WT和Sema7a-/-小鼠中分离皮下和内脏脂肪间充质干细胞，然后诱导皮下和内脏脂肪间充质干细胞成脂分化8天。在形成成熟的脂肪细胞后，通过油红O染色观察和定量脂滴含量，初步探究Sema7A对脂肪细胞分化的影响。<br>　　(2)利用Sema7A重组蛋白，在皮下脂肪间充质干细胞成脂分化过程中的04天中加入不同浓度梯度的Sema7A重组蛋白，以及在皮下脂肪间充质干细胞成脂分化过程的不同时间节点加入10μg/mLSema7A重组蛋白，在成脂分化第8天，通过油红O染色观察和定量脂滴含量，探究Sema7A对脂肪细胞分化抑制作用是否具有浓度和时间依赖性。<br>　　3.Sema7A对脂质合成的影响及其分子机制<br>　　(1)在皮下脂肪间充质干细胞成脂分化过程中加入10μg/mLSema7A重组蛋白，通过q-PCR检测成脂分化过程中不同时间节点脂质合成基因的表达。<br>　　(2)在皮下脂肪间充质干细胞成脂分化的第7天，往培养基中添加10μg/mLSema7A重组蛋白并孵育24小时,通过q-PCR检测脂质合成基因的表达，探究Sema7A对成熟脂肪细胞脂质合成的影响。<br>　　(3)皮下脂肪间充质干细胞成脂分化的第7天，在培养基中分别提前孵育Itgb1封闭抗体和FAK抑制剂半小时，然后添加10μg/mLSema7A重组蛋白并孵育24小时，通过q-PCR检测脂质合成相关基因的表达，探究Sema7A参与成熟脂肪细胞脂质合成的分子机制。<br>　　4.Sema7A重组蛋白对高脂饮食诱导的小鼠肥胖的干预作用<br>　　(1)收集雌性WT小鼠在普通饮食和高脂饮食条件下的血浆，测定血桨中可溶性Sema7A浓度，探究高脂饮食对血浆中可溶性Sema7A浓度的影响。<br>　　(2)将8-10周龄的Sema7a-/-和野生型对照雌性小鼠分为3组，喂食6周的高脂饲料。高脂饲养期间，其中一组Sema7a-/-小鼠每天腹腔注射35μgSema7A重组蛋白，另一组Sema7a-/-小鼠腹腔注射同等体积的溶剂对照，WT小鼠腹腔注射同等体积的溶剂对照，期间定时监测小鼠体重变化。高脂喂养结束后，统计小鼠各部位脂肪组织重量，并对脂肪组织切片染色，观察脂肪细胞形态变化，统计脂肪细胞大小。<br>　　5.SEMA7A及其受体的单核苷酸多态性（Singlenucleotidepolymorphism,SNP)与肥胖及代谢类疾病相关性的分析<br>　　利用GWASCENTRAL(https://www.gwascentral.org/)的全基因组关联研究(Genome-wideassociationanalysis,GWAS)，检索SEMA7A及其受体ITGB1和PLXNC1与体重指数（Bodymassindex,BMI)及其他代谢类疾病指标的相关性。<br>　　研究结果:<br>　　1.在脂肪间充质干细胞成脂分化过程中的0-4天，本研究发现Sema7A及其受体之一Itgb1的mRNA表达不断下降，但是没有检测到另一受体PlxnC1mRNA的表达。<br>　　2.Sema7A抑制脂肪细胞分化且具有浓度和时间依赖性<br>　　(1)相比对照小鼠细胞，Sema7a-/-小鼠的内脏和皮下间脂肪充质干细胞能够形成更多富含脂滴的脂肪细胞，表明Sema7A抑制脂肪细胞分化。<br>　　(2)Setna7A重组蛋白能够显著抑制脂肪细胞分化，并随着其浓度提高抑制作用不断加强。其次，在皮下脂肪间充质干细胞成脂分化过程中的0-2天添加Sema7A重组蛋白，抑制脂肪细胞分化的作用最强。<br>　　3.Sema7A可能通过受体Itgb1和下游FAK信号通路抑制成熟脂肪细胞的脂质合成<br>　　(1)Sema7A重组蛋白能够抑制成脂分化过程中脂质合成基因的表达。<br>　　(2)q-PCR统计结果表明，Sema7A重组蛋白能够抑制成熟脂肪细胞中脂质合成基因的表达。<br>　　(3)q-PCR统计结果表明，Itgb1封闭抗体和FAK信号抑制剂均能够显著减弱Sema7A重组蛋白对成熟脂肪细胞脂质合成的抑制作用。<br>　　4.Sema7A重组蛋白改善高脂饮食诱导的小鼠肥胖<br>　　(1)通过检测血浆中可溶性Sema7A含量，研究发现发现高脂饮食状态下，小鼠血浆中可溶性Sema7A浓度明显低于普通饮食。<br>　　(2)在Sema7A重组蛋白干预肥胖实验中，本研究发现相比Sema7a-/-小鼠腹腔注射溶剂对照，注射Sema7A重组蛋白的小鼠体重和体重增加百分比均有显著性下降，并且注射Sema7A重组蛋白的小鼠生殖器周围脂肪组织和肾脏周围脂肪组织重量以及肾脏周围脂肪内脂肪细胞大小均显著降低。<br>　　5.SEMA7A及其受体的SNP与肥胖和代谢类疾病指标具有相关性<br>　　通过査阅数据库，本研究发现了多个位于SEMA7A及其受体ITGB1和PLXNC1的SNP与BMI、糖化血红糖蛋白和葡萄糖耐受等代谢异常指标具有显著相关性。<br>　　结论:<br>　　本研究中，利用体外脂肪细胞分化体系和高脂饮食诱导的小鼠肥胖模型，探究了Sema7A在脂肪细胞分化和脂质合成中的作用和分子机制，以及Sema7A重组蛋白干预肥胖的可能性。结果显示:1.Sema7A及其受体Itgb1在脂肪间充质干细胞成脂分化过程中表达逐渐下调。2.Sema7A重组蛋白抑制脂肪细胞分化具有浓度和时间依赖性。3.Sema7A重组蛋白抑制成脂分化过程中脂质合成基因的表达。4.Sema7A通过Itgb1-FAK信号通路抑制成熟脂肪细胞的脂质合成。5.Sema7A重组蛋白能够显著改善高脂饮食诱导的小鼠肥胖。6.SEMA7A及其受体基因中含有众多与肥胖及代谢类疾病指标相关的SNP。