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摘要免疫分析是指利用抗体与抗原或半抗原之间的高度特异性结合实现对化学物质（如激素、药物和特定蛋白质）的定性、定量分析，其极好的准确性和可操作性为疾病诊断、食品安全和环境保护等领域内的深入研究提供了可靠的数据支撑。表面增强拉曼散射(SERS)以其高灵敏度、高选择性和丰富的分子结构信息，在物理、化学、生物等领域引起了广泛的关注。电化学分析方法则具有检测限低、价格低廉、易于小型化和自动分析检测等优点。因此，将SERS和电化学作为可靠的读出方法应用于蛋白质及小分子物质的免疫分析，克服现有读出方法灵敏度低、分辨率差、难以实现多路检测等缺陷，成为免疫分析领域的研究热点之一。本论文通过构筑一类具有二维有序球腔阵列结构的金、银基底及微电极阵列作为支持基质及SERS基底，一类富银的金银双金属纳米颗粒作为纳米免疫探针，结合杂交链式反应技术(HCR)及免疫识别形成“超级三明治”式的免疫复合物，以SERS和电化学手段为信号读出方法构建了多种免疫生物传感器并用于实际样品的检测。主要研究内容和成果如下:<br>　　(1)利用简便的方法制备了可作为SERS探针的Au/Ag双金属纳米颗粒。制备过程中充分利用反应体系中过量的还原剂，通过对反应条件的精细控制，获得了表面洁净、富银的Au/Ag纳米颗粒(BNPs)。系统研究了BNPs的形成机理，证明了这种纳米颗粒的构建过程实际上是初始置换反应、柠檬酸盐共还原Ag+以及合金化和脱合金化之间的相互作用。由于BNPs中银的富集，其具有很强的SERS增强效果，增强因子可达2.3×106。将该BNPs作为纳米探针，将抗体和探针分子引入复合免疫体系。再结合金染，构建了一个Au/蛋白质免疫复合物/Au/Ag岛膜“超级三明治”结构实现对兔免疫球蛋白G(IgG)的SERS免疫分析，检测限低至10pg·L-1。<br>　　(2)构建了一类增强效果好，重现性高的SERS基底。采用自组装方法，在气液界面铺设了一系列结构规整的二维密堆积聚苯乙烯(PS)微球（直径为500，600，700，800，1000nm及1.2，1.5，2μm），结合电沉积方法制备了贵金属（金、银、金/银双金属）球腔阵列。通过改变电沉积过程中所通过的电量，可实现对球腔形貌（孔径、深度）的调控。考察了基底形貌，基底局域表面等离子体共振(LSPR)与SERS增强能力间的相关性，并给出理论解释。<br>　　(3)以高度有序LSPR可调的金球腔阵列(GCA)为基底，构建了基于SERS的竞争免疫传感器用于β-肾上腺素受体激动剂中沙丁胺醇(SAL)和溴布特罗(BRO)的同时检测。杂交链式反应(HCR)形成双链的DNA串联体，其带负电的磷酸盐骨架可用于负载荷正电的标记分子耐尔兰(NB)以及3，3''，5，5''-四甲基联苯胺(TMB)，从而极大增加了标记分子的负载量，起到信号倍增作用。结合免疫识别反应和银染，GCA所检测到的标记分子特征峰的SERS强度与目标分析物浓度成反比，可用于SAL和BRO的同时定性定量分析。方法对于SAL和BRO的检测限分别为1.0pg·mL-1和2.0pg·mL-1。方法用于猪肉、肝脏和人尿样品分析加标回收率为96.7-105.3％，相对标准偏差(RSD)为4.9-8.7％。<br>　　(4)在前述工作的基础上，制备了金银双金属球腔阵列(BMCA)，发展了一种可实现SERS和电化学双读出信号的竞争免疫分析法，用于同时检测p-肾上腺素受体激动剂。BMCA的形貌和组成可以通过改变前驱体中金和银的摩尔比加以调节，当金、银比率为6∶4时，制得的BMCA具有规则的形貌、优异的SERS增强和信号再现性。随后精心挑选三种具有清晰可分辨的电化学和拉曼特征峰的标记分子，用于沙丁胺醇(SAL)，莱克多巴胺（RAC）以及苯乙醇胺A(PA)的同时定性定量检测。拉曼特征峰的强度和方波伏安法的峰电流与分析物浓度成反比，在1pg·mL-1至200·ng mL-1的宽浓度范围内，该免疫传感器对SAL、RAC和PA的检测限分别为0.8、0.4和1.3pg·mL-1。该方法用于真实样品的分析，回收率为95.0-108.5％，RSD为6.9-10.7％。<br>　　(5)采用密堆积二维二氧化硅球腔为模板，在球腔底部电沉积金纳米颗粒，制备了一类SiO2球腔隔绝，中心距离可调的的金纳米微电极阵列(GMA)。该阵列电极展现出显著的微电极特性，包括高信噪比，高电流密度，高信号分辨率等，从而起到传输增强的电化学信号的作用。随后以巯基二茂铁(Fc-SH)为标记分子提供内源性电化学信号，载于AuNPs上的识别抗体（抗CEA，Ab2）提供生物检测/相互作用能力。Fc-AuNPs抗CEA探针通过巯基自组装在金纳米颗粒上负载了大量Fc分子，实现了信号放大，从而提高了免疫传感器的灵敏度，检测限低至0.01ng·mL-1。该传感器在实际血清样品中的测试也显示出良好的回收率。