检索历史 清除

摘要动脉粥样硬化是一种多因素共同作用的慢性血管炎症性疾病过程。尽管多年以来在动脉粥样硬化的预防和治疗领域已有较多进展，但其仍是全世界心血管疾病发病率和死亡率居高不下的主要原因之一。血液扰动流是一种常发生于血管分叉及弯曲处的低频振荡剪切应力，其在动脉粥样硬化发生和发展中起到至关重要的作用。在存有扰动流的区域，血管和血管壁细胞发生包括内皮功能障碍，炎症，血管新生，内皮细胞间质化改变，细胞凋亡，平滑肌细胞迁移和细胞外基质重塑等显著改变。这些改变增加了动脉粥样硬化发生发展的风险。使用DNA微阵列和普通转录组测序技术，以往的研究发现扰流状态下脉管系统中一些机械敏感基因和信号通路的激活。然而，对于单个细胞的分子表达谱和细胞功能异质性仍不清楚。近年来，运用单细胞转录组测序技术，研究人员已发现动脉粥样硬化斑块中的免疫细胞和血管壁细胞均存在功能异质性。然而，血液扰动流本身是否可以改变血管壁细胞的功能异质性还不清楚。我们最近的研究发现轴突导向分子Sema7A响应扰动流，参与动脉粥样硬化，但Sema7A是否影响扰动流诱导的细胞异质性改变尚不清楚。为了进一步研究扰动流和Sema7A参与动脉粥样硬化的机制，本文建立了扰动流诱导的血管壁细胞图谱，发现扰动流可诱导产生新型血管壁细胞亚群，并且Sema7A主要参与扰动流诱导的血管壁平滑肌细胞的功能异质性改变。<br>　　研究目的：<br>　　阐明Sema7A在扰动流诱导的颈动脉细胞功能异质性改变中的作用。<br>　　研究方法：<br>　　(1)在小鼠体内使用颈动脉部分结扎模型制造血液扰动流;(2)使用胶原酶/DNA酶联合胰酶的二步消化法对扰流刺激的小鼠左颈动脉进行消化以获得单细胞悬液;(3)利用10×Genomics平台将单细胞悬液标记，然后建库和测序;(4)使用Seurat包对获得的单细胞原始数据进行整合分析;(5)通过基因集变异分析对各细胞亚群进行功能注释;(6)通过细胞周期分析对细胞亚群所处细胞周期进行判定;(7)利用拟时间序列分析对细胞亚群转换进行生物信息学预测;(8)使用蛋白质免疫印迹，免疫荧光和en face免疫染色技术对扰动流相关的细胞亚群进行鉴定和定位;(9)使用Seurat包对各个样本的细胞数进行计算并分析相对丰度;(10)构建Sema7A过表达的人源平滑肌细胞系以探索Sema7A对平滑肌细胞表型转换的影响;(11)通过纯化Sema7A重组蛋白刺激人源平滑肌细胞系以确定平滑肌细胞表型转换;(12)利用Sema7A过表达的人源平滑肌细胞系进行普通转录组测序以探索潜在调控机制。<br>　　研究结果：<br>　　(1)通过单细胞原始数据整合和分析，发现扰动流组左颈动脉的血管壁存在平滑肌细胞，成纤维细胞，巨噬细胞/树突状细胞，内皮细胞，淋巴细胞和粒细胞六种细胞类型，绘制了小鼠左颈动脉细胞图谱。<br>　　(2)对内皮细胞进行二次分群后，鉴定Dkk2hi ECs和Cd36hi ECs是扰动流诱导的两种内皮细胞亚群。其中，Dkk2hi ECs是一群由扰动流调控的机械敏感内皮细胞亚群，并且拟时间序列分析显示，Dkk2hi ECs可能是由扰动流诱导正常内皮细胞亚群Klk8hi ECs产生。同时，发现Dkk2hi ECs和Cd36hi ECs也存在于正常生理状态下发生扰动流的主动脉弓小弯处和高脂诱导的动脉粥样硬化斑块中。<br>　　(3)扰动流状态下的血管壁存在Trem2hi Mφ、Res-like Mφ和Birc5hi Mφ三种巨噬细胞亚群。其中，鉴定出Birc5hi Mφ是一种高增殖力的新型巨噬细胞亚群，提示其可能是促进动脉粥样硬化巨噬细胞积聚的主导者。<br>　　(4)扰动流状态下血管壁细胞中存在CD4+T cells、CXCR6+T cells、NK cells和粒细胞，分别在T细胞分化和凋亡，应对氧气水平、胰岛素和激素，细胞杀伤和白细胞积聚中发挥重要作用。<br>　　(5)对平滑肌细胞进行二次分群后，发现一群扰动流诱导的Spp1hi VSMCs。与对照组存在的两种VSMCs亚群相比，其具有特定的生物学功能如成骨细胞分化，胶原蛋白生物合成过程，血管重塑和衰老。<br>　　(6)细胞比例分析发现在扰动流发生后平滑肌细胞比例相对减少而成纤维细胞和巨噬细胞比例相对增多。而Sema7A敲除后，成纤维细胞比例明显减少而平滑肌细胞比例增加。<br>　　(7)Sema7A敲除后抑制Dkk2hi ECs发挥多种生物学功能如整合素介导的细胞粘附、细胞迁移和软骨细胞分化。而在Cd36hi ECs中，Sema7A可行使血管新生、缺氧反应、机械力响应和细胞分化等生物学功能。<br>　　(8)Sema7A敲除后抑制Trem2hi Mφ中胶原相关分子Co13a1和Col1a1的表达促进平滑肌细胞相关标志物Acta2和Tagln的表达。此外，Sema7A敲除抑制Birc5hi Mφ增殖标志物Top2a、Ube2c和Mki67的表达。<br>　　(9)Sema7A敲除后可明显降低成纤维细胞亚群中由扰动流诱导的Spp1hi VSMCs形成的纤维软骨样细胞比例。<br>　　(10)过表达平滑肌细胞Sema7A和加入人源重组Sema7A蛋白均能够减低平滑肌细胞标志物α-SMA和Cnn1表达，增加纤维软骨样细胞标志物Col1a1和Col3a1的表达。<br>　　研究结论：<br>　　1.我们对颈动脉血管壁进行单细胞转录组测序后发现10个不同的扰动流相关细胞亚群:Dkk2hi ECs、Cd36hi ECs、Spp1hi VSMCs、Trem2hi Mφ、DCs、Birc5hi Mφ、CD4+T细胞、CXCR6+T细胞、NK细胞和粒细胞。<br>　　2.Dkk2hi ECs是一个机械力敏感的内皮细胞亚群，而Birc5hi Mφ在扰动流状态下是具有高增殖力的巨噬细胞亚群。Dkk2hi ECs和Cd36hi ECs还存在于主动脉弓小弯处和高脂诱导的动脉粥样硬化斑块中，提示它们在动脉粥样硬化中的潜在作用。Spp1hi VSMCs是一群由扰动流产生的具有成骨细胞分化和胶原蛋白生物合成等特殊功能的新型平滑肌细胞亚群。<br>　　3.Sema7A敲除可通过减弱由扰动流诱导的Spp1hi VSMCs向纤维软骨样细胞转变来降低扰动流诱导的成纤维细胞比例升高而平滑肌细胞比例降低。进一步体外实验证实，Sema7A促进平滑肌细胞向纤维软骨样细胞转变。