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摘要第一部分小鼠重症急性胰腺炎模型的建立目的:建立重症急性胰腺炎小鼠动物模型，观察重症急性胰腺炎小鼠一般情况和生存情况，评估小鼠胰腺病理损伤以及血清学指标改变，为后续的研究建立动物模型。<br>　　方法:将8.10周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠(体重23-25g)禁食8-12h后，采用胆胰管逆行注射牛磺胆酸钠(sodiumtaurocholate;NaTC)的方法建立小鼠重症急性胰腺炎模型，其中对照组(Control;n=10)经胆胰管逆行注射0.9％无菌生理盐水10μL/只，重症急性胰腺炎组(severeacutepancreatitis，SAP;n=10)采用同样的方式注射等体积5％NaTC。术后观察小鼠的一般状态，并于术后24h麻醉小鼠，先抽取其腹主动脉血同时收集胰腺、肺组织标本，其中血液样本通过离心收集血清，检测血清淀粉酶、脂肪酶、肝功能(谷丙转氨酶[alanineaminotransferase;ALT]和谷草转氨酶[aspanateaminotmsferase;AST])、肾功能(血尿素氮[bloodureanitrogen;BUN]和肌酐[Creatine;Cr])、炎症因子水平(白介素-6[Interleukin-6;IL-6]);组织样本采用石蜡包埋后，切片并进行苏木素-伊红(hematoxylin-eosinstaining;HE)染色，采用盲法进行胰腺组织病理学评分;另外，部分胰腺和肺脏组织标本用于髓过氧化物酶(Myeloperoxidase;MPO)的检测。采用R软件对所有数据进行统计学分析及可视化，上述获得的计量资料采用均数士标准差表示，通过两独立样本t检验进行比较，p＜O.05表示差异有统计学意义。<br>　　结果:手术成功率＞95％，Control组72h生存率为100％(8/8):SAP组，24h生存率为82.4％(9/11)，48和72h生存率均为72.7％(8/11)。术后24h的病理结果显示:SAP组相较于Control组小鼠胰腺组织可见明显水肿(p＜0.001)、炎症细胞浸润(p=O.008)、腺泡坏死(p＜O.001)、胰腺组织病理学评分(7.72±1.61vs.0.10±0.08，p＜0.001)显著升高。相较于control组，SAP组血清淀粉酶([46740.32±12801.30]U/Lvs.[3324.40±753.66]U/L，p＜0.001)、脂肪酶([545.02±356.28]U/Lvs.[18.32±25.22]U/L，p=0.030)、IL-6[48.73±25.28]pg/mL]vs.[10.08±3.11]pg/mL]，p=O.026)、ALT([164.36±47.66]U/Lvs.[77.15±31.06]U/L，p＜0.001)、AST([222.35±82.13]U/Lvs.[116.61±64.79]U/L，p=0.005)、BUN([37.59±16.36]mmol/Lvs.[14.80±3.74]mmol/L，p=0.003)、Cr([40.33±11.53]μmol/Lvs.[28.66±4.53]μmol/L，p=0.012)水平均升高;胰腺组织和肺组织MPO活性显著升高(胰腺:[5.18±3.26]U/gvs.[O.71±0.41]U/g，p=0.011;肺:[11.70±1.31]U/gvs.[1.56±0.45]U/g，p＜0.001);胰腺组织和肺组织湿重/干重(wet/dry;W/D)比值显著升高(胰腺:[5.11±0.16]U/gvs.[4.40±O.24]U/g，p＜0.001;肺:[5.11±0.41]U/gvs.[4.41±0.19]U/g，p=0.014)，差异有统计学意义。<br>　　结论:我们采用胆胰管逆行注射NaTC的方法成功建立小鼠重症急性胰腺炎模型。<br>　　第二部分转录组测序分析重症急性胰腺炎模型鼠基因表达调控网络目的:基于第一部分建立的SAP模型，通过将胰腺组织进行上游转录组测序及下游生信分析，明确在SAP的病理生理过程中发挥关键作用的基因调控网络。<br>　　方法:同样采用胆胰管逆行注射NaTC的方法建立重症急性胰腺炎的小鼠模型。将15只小鼠随机分为Control组(n=3)和SAP组(n=12)，于术后24h麻醉小鼠，抽取腹主动脉血，分离血清并检测淀粉酶和脂肪酶。处死小鼠后迅速收集胰腺组织，迅速剪碎于液氮中速冻，15min以后转移至-80℃冰箱贮存。收集样本后，由上海欧易生物协助进行转录组测序。对所有样本的基因表达谱进行权重基因共表达网络分析(weightedgeneco-expressionnetworka11alysis;WGCNA)及基因集富集分析(genesetenrichmentanalysis;GSEA)，再结合差异分析结果，筛选出与急性胰腺炎发病相关的关键模块和核心基因。<br>　　结果:wGCNA分析结果显示:所有基因被划分为8个模块，与淀粉酶高度相关的模块为MEturquoise(r=O.92，p＜0.001)。另外，MEbrown和MEblack模块与MEturquoise模块的表达模式相似。进一步进行GO和KEGG富集分析，结果表明，MEtuoise模块主要富集到细胞因子-细胞因子相互作用通路，与白细胞黏附等生物学过程相关。而对关键模块MEturquoise中的4050个基因进行GSEA分析，结果显示该模块内的基因在细胞因子-细胞因子通路、MAPK通路、TLR受体信号通路、血小板激活相关通路显著富集。关键模块MEturquoise的GSEA结果显示:血小板α颗粒相关基因在急性胰腺炎中显著富集，提示血小板激活在急性胰腺炎的发病过程中发挥着重要作用。另外，通过基因显著性(genesignificance;GS)值大于0.25且模块身份(modulemembership;MM)值大于0.8筛选出关键模块中的核心基因包括血小板因子4(plateletfactor4;PF4)在内的2371个基因。进一步与差异倍数(foldchallge;FC)大于2的1282个差异基因取交集，发现关键基因为包含血小板相关的PF4在内的590个基因。<br>　　结论:通过对转录组测序得到的表达谱进行WGCNA、GSEA以及差异分析，筛选出与急性胰腺炎高度相关的关键基因为包含血小板分泌及血小板相关的PF4在内的590个基因。<br>　　第三部分P2Y12受体在重症急性胰腺炎的发生中的作用及其机制探究目的:明确P2Y12受体在SAP中的作用效应，并初步探索可能的机制。<br>　　方法:采用第一部分中的方法建立小鼠SAP模型。将8-10周龄SPF级C57BL/6背景的野生型(wild-type;WT)和P2Y12全身性基因敲除小鼠纯合子(P2Y12)，体重23-25g，随机分为Control(n=5)和SAP(n=6)组。所有小鼠禁食8-12h，自由饮水，Control组经胆胰管逆行注射0.9％无菌生理盐水10μ/L只，SAP组采用同样的方式注射等体积5％NaTC。于术后24h麻醉小鼠，抽取其腹主动脉血，离心后收集血清，检测血清淀粉酶和脂肪酶水平。于术后24h，处死小鼠，取胰腺和肺组织标本，石蜡包埋后，切片并进行HE染色以及免疫组化，采用盲法对胰腺组织切片进行组织病理学评分，用IIIlageJ对免疫组化阳性面积进行统计。<br>　　结果:术后24h，SAP模型中，P2Y12-/-与WT小鼠相比，P2Y12-/-小鼠胰腺水肿(1.94±0.61vs.3.15±O.51，p=0.019)、坏死((1.25±0.87vs.3.03±0.77，p=O.016)程度显著改善，组织病理学评分总分(5.41±0.92vs.7.72±1.6l，p=0.021)显著下降，但炎症细胞浸润(1.42±O.81vs.1.70±0.80，p=0.599)和胰腺组织出血(0.52±O.35vs.0.001±0，p=O.063)无明显差异;P2Y12-/-小鼠血清淀粉酶(([346.20±10.10]U/dLvs.[388.44±19.26]U/dL，p=O.0445)和脂肪酶([233.16±175.18]U/Lvs.[743.21±266.92]U/L，p=0.009)水平显著降低，胰腺组织MPO([2.46±O.27]U/Lvs.[6.39±3.11]U/L，p=0.047)活性、MPO免疫组化阳性率([1.87±0.30]％vs.[4.02±1.70]％，p=0.046)显著降低，肺组织MPO活性([9.48±0.35]U/Lvs.[12.08±1.02]U/L，p=0.003)显著下降;血清PF4([2227.00±1206.79]ng/mLvs.[11697.33±818.59]ng/mL，p＜O.001)水平显著降低。<br>　　结论:P2Y12在急性胰腺炎的早期炎症中促进炎症的发生，P2Y12被敲除后对急性胰腺炎小鼠具有保护意义，这一作用可能与血小板相关的PF4的分泌有关。