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摘要目的:氡是一种放射性气体，发射α、β、γ射线。氡暴露是仅次于吸烟的第二大肺癌致病因素，但其致癌机制尚不明确。电离辐射会导致DNA双链断裂(Double-strandbreak，DSB)，DSB通过诱发基因组不稳定性而与肿瘤的发生发展关系密切。DSB发生后，细胞启动DNA损伤应答(DNAdamageresponse，DDR)反应，包括激活DNA修复蛋白、导致细胞周期阻滞、诱导自噬或细胞凋亡。共济失调毛细血管扩张突变(Ataxiatelangiectasia-mutated，ATM)蛋白是重要的DNA损伤信号传感器，位于DSB触发的DNA损伤应答反应的上游。自噬被DNA损伤信号激活参与DSB的修复，根据DNA损伤严重程度促进或抑制细胞死亡。已知ATM通过调控自噬维持细胞的氧化还原稳态，但二者在电离辐射诱导的DNA损伤应答反应中的作用尚不清楚。目前关于氡暴露与DSB及其损伤应答反应的研究很少，该方面研究有助于探索氡致肺癌的生物学机制。为了研究ATM与自噬在氡暴露诱导的DNA损伤应答中的作用，以氡暴露处理的BALB/c小鼠、氡暴露处理的人正常肺支气管上皮(BEAS-2B)细胞、ATM抑制剂KU-55933联合氡暴露处理的BEAS-2B细胞以及自噬抑制剂3.甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)联合氡暴露处理的BEAS-2B细胞作为实验材料，研究氡暴露后小鼠肺组织和BEAS-2B细胞的DNA双链断裂情况，以及经氡暴露后细胞内的DNA损伤应答反应，即DNA关键修复基因与蛋白以及自噬的改变，并且探讨了ATM如何调控自噬参与氡诱导的DNA损伤应答反应。<br>　　方法:(1)氡暴露处理BALB/c小鼠:6～8周龄SPF级雄性BALB/c小鼠，随机分为氡暴露组(Rn)和对照组(Ctrl)。氡暴露组小鼠分别染氡3、6、9个月，氡气体浓度为50000Bq/m3，每天染氡8h，每周染氡6天;3个暴露时间点(3、6、9个月)分别设置相应对照组，对照组饲养在氡浓度为环境本底氡水平的房间内;(2)氡暴露处理BEAS-2B细胞:细胞分为氡暴露组(Rn)和对照组(Ctrl)。氡暴露组:氡暴露组细胞于20000Bq/m3氡浓度下暴露处理20min，对照组细胞不作染氡处理。按上述方法处理1次作为氡暴露第1代(记为Rn-1)，重复处理10次(记为Rn-10)，取Ctrl，Rn-1、Rn-5、Rn-10四组细胞用于后续实验;(3)ATM抑制剂KU-55933联合氡暴露处理BEAS-2B细胞(ATMi+Rn):用二甲基亚砜(Dimethvlsulfoxide，DMSO)溶解、培养基稀释KU-55933，每次氡照射前用10nMKU-55933预处理BEAS-2B细胞12h后撤去，再进行上述氡暴露处理;(4)自噬抑制剂3-MA联合氡暴露处理BEAS-2B细胞(3-MA+Rn):3-MA用培养基溶解稀释，每次氡照射前用5μM3-MA预处理BEAS-2B细胞12h后撤去，再进行上述氡暴露处理;(5)a.通过免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)染色和实时荧光定量PCR(Realtime-qPCR)、免疫荧光染色检测BALB/c小鼠肺组织和BEAS-2B细胞内DNA双链断裂情况，PCR和WestemBlot检测BEAS-2B细胞内ATM基因和蛋白的表达;b.免疫组织化学染色检测小鼠肺组织中DNA修复蛋白KU80的表达情况，PCR检测小鼠肺组织和细胞内DNA修复基因在mRNA水平的变化，WestemBlot检测细胞内DNA修复蛋白和小鼠肺组织自噬蛋白的变化，单丹磺酰尸胺(Monodansylcadaverine，MDC)染色法观察细胞内自噬小体的情况;c.通过流式细胞术和WestemBlot评估ATM抑制剂对BEAS-2B细胞内细胞周期、凋亡水平以及凋亡、自噬相关蛋白表达水平的影响;d.PCR检测自噬抑制剂3.MA对DNA修复基因mRNA水平的影响。<br>　　结果:第一部分:小鼠肺组织免疫组织化学染色结果显示，随着氡暴露时间的延长，氡暴露组γ-H2Ax蛋白表达逐渐增强:PCR结果表明，与对照组比较，Rn-1、Rn-5、Rn-10组BEAS-2B细胞内γ-H2AX和ATM基因的表达水平均显著增加(P＜0.05);wrestemB10t结果显示，与对照组比较，Rn-1、Rn-5、Rn-10组BEAS-2B细胞内p-ATM蛋白显著增加(P＜0.05);免疫荧光实验发现，随着染氡代数的增加，BEAS-2B细胞内γ-H2AX平均荧光强度依次升高(P＜0.05)。以上结果表明，氡暴露导致小鼠肺组织和BEAS-2B细胞内DNA双链断裂，且呈剂量依赖性，氡暴露促进了BEAS-2B细胞内ATM蛋白磷酸化。<br>　　第二部分:免疫组织化学染色结果表明，3、6、9个月氡暴露组小鼠肺组织非同源末端连接修复(Non-homologousendjoining，NHEJ)蛋白KU80表达水平依次逐渐增高(P＜0.05);经氡照射后，9个月氡暴露组小鼠肺组织和Rn-1、Rn-5、Rn-10组BEAS-2B细胞内NHEJ修复基因KU80、XLFmRNA水平均升高(P＜0.05):经氡照射10代(Rn-10)的BEAS。2B细胞内XLF、LIG4、Anemis等NHEJ修复蛋白表达水平升高(P＜0.05);我们还检测了小鼠肺组织中自噬标志蛋白p62、Beclin1、LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表达水平，与对照组比较，经氡照射3个月后，p62和LC3B-Ⅱ/Ⅰ均下降(P＜0.05)，Beclin1无显著变化，提示此时自噬溶酶体降解增加;染氡6个月组，LC3B-Ⅱ/Ⅰ升高、p62下降(P＜0.05);染氡9个月组，Beclinl和LC3B-Ⅱ/Ⅰ均升高(P＜0.05)，p62与对照组比较有所下降，说明自噬体形成与降解正常，即自噬被激活。同时MDC荧光染色结果显示，染氡细胞内自噬小体数量增多，自噬活动增强。氡暴露激活了小鼠肺组织和BEAS-2B细胞内NHEJ途径和自噬。<br>　　第三部分:细胞周期检测结果表明，与对照组比较，Rn-10组停滞在G2/M期的细胞显著增多(P＜0.05)，与Rn-1组比较，ATMi+Rn-1组G2/M期的细胞增多(P＜0.05)，与Rn-10组比较，ATMi+Rn-10组处于G2/M期的细胞显著减少(P＜0.05)，提示ATM可能参与了氡诱导的BEAS-2B细胞G2/M期阻滞。流式结果显示，与对照组比较，染氡细胞凋亡水平没有显著变化。为了进一步研究ATM对染氡细胞凋亡水平的调控，通过WestemBlot检测了凋亡相关蛋白的表达，结果显示，Rn-10组细胞内Bax/Bcl.2的比值较对照组显著增加(P＜0.05)，使用ATM抑制剂后，染氡细胞内p_p38MAPK和Bax蛋白水平升高(P＜0.05)，表明ATM抑制剂联合氡暴露处理可能触发了独立于ATM的p38MAP刚Bax凋亡途径。与Rn-1组比较，ATMi+Rn-1组p62、Beclinl显著减少(P＜0.05)、LC3B-Ⅱ/Ⅰ有所下降，提示染氡初期ATM抑制剂KU.55933引起自噬被过度激活，导致自噬受体蛋白p62下降，及自噬溶酶体降解过程中Beclinl和LC3B-Ⅱ消耗增加;与Rn-5组比较，ATMi+Rn-5组p62开始累积，LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclinl显著下降(P＜0.05)，与Rn-10组比较，ATMi+Rn-10组p62显著增加，LC3B-Ⅱ/Ⅰ显著下降(P＜0.05)，说明从第5代开始，ATM抑制剂KU。55933使自噬小体形成减少并导致自噬底物降解受阻，即抑制ATM蛋白阻断了氡暴露激活的自噬。PCR检测发现，单独3.MA处理和单独氡暴露处理能够提高NHEJ修复基因殷，F和LIG4的表达水平，而在氡暴露之前使用3.MA预处理则会抑制NHEJ修复基因XLF、LIG4的表达水平。<br>　　结论:1.氡暴露促进BEAs-2B细胞内ATM蛋白磷酸化，氡暴露后小鼠肺组织和BEAS-2B细胞内γ-H2AX表达增加，体内外实验均表明氡及其子体剂量依赖性地诱导DNA双链断裂;<br>　　2.氡暴露激活了小鼠肺组织和BEAS-2B细胞内非同源末端连接修复(NHEJ)途径、诱导了促生存自噬;<br>　　3.在BEAS-2B细胞中，氡暴露引起G2/M期阻滞，抑制细胞进入有丝分裂，并导致促凋亡蛋白Ba)[增加和抗凋亡蛋白Bcl-2减少，提高了细胞凋亡水平;<br>　　4.ATM抑制剂I叫.55933联合氡暴露处理扰乱了染氡细胞内的G2/M期阻滞、导致BaX/Bcl-2比值升高，即ATM参与调控氡暴露诱导的G2/M期阻滞和细胞凋亡:<br>　　5.ATM抑制剂KU-55933联合氡暴露处理触发了p38MAPl(/Bax凋亡通路，并阻断了氡激活的自噬，ATM可根据氡暴露导致的细胞内DSB严重程度的不同协调细胞自噬和细胞凋亡水平;<br>　　6.在染氡细胞中，抑制自噬降低了NHEJ修复基因XLF、LIG4在mRNA水平的表达，ATM可能通过调控自噬激活NHEJ修复基因和蛋白的表达，启动染氡细胞内NHEJ修复途径参与DNA损伤应答。