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摘要支气管哮喘(简称哮喘)是儿童最常见的气道慢性炎症性疾病。近年来，世界范围内哮喘的发病率和死亡率逐渐上升，这使人类的健康受到了极其大的威胁，也使整个家庭和整个社会背负了巨额的经济负担。哮喘已经成为全球范围内亟待解决的公共卫生难题，从哮喘发病机制层面寻找干预措施是临床急需要解决的实际问题。哮喘的发病机制极为复杂，目前其具体的发病机制尚无确切定论。辅助性T细胞1型(Th1)功能受到抑制，辅助性T细胞2型(Th2)功能亢进所导致的Thl/Th2不平衡目前被认为是导致哮喘发病最主要的原因。但仅仅依靠Thl/Th2失衡的理论并不能解释所有实验现象，哮喘的发生可能涉及更多其它的细胞群体。随着Th9细胞这个新的CD4+Th细胞亚群的发现，越来越多的研究开始关注这群细胞在哮喘免疫病理中的作用。Th9细胞是IL-4和TGF-13刺激NaiveCD4+T细胞分化而来的，同时产生大量的IL-9。分泌IL-9的Th9细胞在哮喘免疫病理中起着重要的作用。近年来，起初被认为是转录组“噪音”的microRNAs(miRNAs)日益受到研究者的关注，miRNA是非编码RNA，长度为18～25个核苷酸，在进化过程中高度保守，它们与信使RNA(messageRNA，mRNA)的3’非翻译区(3’UntranslatedRegions，3’UTR)结合后能够导致基因翻译受到抑制，进而降低靶基因的表达，在许多疾病发病机制中的作用己被广泛研究。越来越多的证据表明miRNAs参与哮喘的气道炎症调节，本课题通过高通量测序再结合GO分析、KEGG信号通路分析、信息学分析和已发表的数据库筛选出哮喘组和对照组差异表达的miRNAs，即miR-493-5p，探讨其在哮喘中对Th9细胞分化的影响。<br>　　第一部分 哮喘患儿外周血mLR-493-5p、FOX01、IL-9的表达及临床意义<br>　　目的:探讨哮喘患儿外周血miR一493-5p、FOX01和IL-9的表达情况及与临床资料、相关实验室检查等之间的关联性。<br>　　方法:1、选取2017年9月～2019年6月在苏州大学附属儿童医院呼吸科住院的哮喘患儿30例，纳入标准参照《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》，选取同一时间范围内在苏州大学附属儿童医院外科行择期手术的患儿32例作为健康对照组。同时收集两组患儿的临床资料及相关实验室检查，包括性别、年龄、哮喘患儿外周血嗜酸性粒细胞比例、外周血总IgE水平、FEVI％、FeNO、住院天数等。<br>　　2、收集哮喘组和健康对照组患儿外周血标本，通过高通量测序再结合GO分析、KEGG信号通路分析、信息学分析和己发表的数据库筛选出差异表达的miRNAs。<br>　　3、qRT-PCR(荧光实时定量PCR)检测两组患儿外周血miR-493-5p、FOX01、IL-9的表达情况，并进行相关性分析;用哮喘组患儿外周血miR-493-5p的表达水平与临床资料及相关实验室检查进行相关性分析。<br>　　结果:1、高通量测序及验证发现哮喘患儿外周血miR-493-5p与健康对照组相比呈显著降低且可能与Th细胞分化有关。<br>　　2、与健康对照组相比较，哮喘组患儿外周血miR-493-5p的表达水平明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05);而外周血FOX01、IL-4和IL-9的表达水平与健康对照组相比则明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。<br>　　3、哮喘患儿外周血miR-493-5p的表达水平与FOX01(F-0.519，P＜0.05)、IL-9(r=0.684，P＜0.01)、IL一4(r=0.589，P＜0.01)、外周血嗜酸性粒细胞比例(r=-0.671，P＜0.01)、外周血总IgE水平(r=-0.631，P＜0.01)、FEVl％(r=-0.827，P＜0.01)、FeNO水平(r=0.726，P＜0.01)均有负相关关系;但是与哮喘患儿的年龄(r=0.180，P＞0.05)和住院天数(r=0.117，P＞0.05)不存在相关性。<br>　　结论:哮喘患儿体内miR-493-5p的表达水平是降低的，且与FOX01、IL-9、IL-4、外周血中过敏性炎症指标、FEVl％和FeNO均呈负相关。<br>　　第二部分 MiR-493-5p/FOX01/Th9细胞逐级调控的作用及机制<br>　　目的:预测并且验证miR-493-5p的靶基因是FOX01，探讨miR-493-5p通过靶向作用于FOX01调控Th9细胞分化的机制。<br>　　方法:1、分选WT小鼠NaiveCD4+T细胞，将miR-493-5pmimic和miR-493-5pinhibitor转染入NaiveCD4+T细胞，在Th9诱导分化培养体系中培养7d后采用流式细胞仪和ELISA检测IL-9的表达水平，同时用qRT-PCR和WesternBlot检测miR-493-5p、FOX01、IRF4、IL-9的mRNA水平和蛋白水平。<br>　　2、通过TargetScan、starBasev2-0等软件分析miR-493-5p的生物学信息及其可能的靶基因;通过双荧光素酶报告基因实验验证FOX01是miR-493-5p的靶基因。<br>　　结果:1、在诱导NaiveCD4+T细胞向Th9方向分化时，细胞中过表达miR-493-5p可下调FOX01、IL-9和IRF4的rnRNA水平和蛋白水平，而沉默miR-493-5p可上调FOX01、IL-9和IRF4的mRNA水平和蛋白水平，提示过表达或沉默miR-493-5p可以抑制或促进Th9细胞分化。<br>　　2、TargetScan、starBasev2-0等软件预测结果显示FOX01可能是miR-493-5p的直接靶基因。双荧光素酶结果表明miR-493-5p能够直接结合FOX01基因3''UTR区从而下调FOX01的表达，明确了FOX01是miR-493-5p的靶基因。<br>　　结论:miR-493-5p通过靶向作用于FOX01抑制Th9细胞的分化和IL-9的产生，提示miR-493-5p有望作为治疗哮喘的潜在靶点。<br>　　第三部分 过表达miR-493-5p在OVA致敏的哮喘模型中的作用<br>　　目的:构建OVA致敏的哮喘小鼠模型，给予miR-493-5pagomiR干预以达到体内miR-493-5p的过表达状态，探讨miR-493-5p在哮喘发病机制中调控Th9细胞分化的作用。<br>　　方法:1、将6-8w的雌性BALB/c小鼠随机分成4组:Controlgroup、Asthmagroup、IIliR-493-5pagomiRgroup和agomiRNCgroup，每组8只。<br>　　2、构建OVA哮喘模型:第0d和第7d给予腹腔注射OVA致敏混合溶液1009F只;第17d、18d、19d、20d进行OVA雾化激发;第21d收集肺组织、BALF以及血浆等进行后续检测。miR493-5pago血Rgroup在第14d、15d、16d通过滴鼻方式给予miR-493-5pagomiR40pl。<br>　　结果:1、与对照组比较，OVA哮喘组小鼠的行为学评分明显增加;而气道高表达miRq93-5p后OVA哮喘小鼠的行为学评分与OVA哮喘组相比则明显降低，说明哮喘小鼠气道高表达miRd93-5p对哮喘小鼠的行为学症状能起到缓解的效果。<br>　　2、OVA哮喘小鼠气道的反应性随着乙酰甲胆碱浓度的增加而逐渐升高，但气道高表达miR-493-5p后气道反应性则降低，这对于改善气道症状是非常有利的，具有保护作用。<br>　　3、哮喘小鼠气道高表达miR-493-5p后，炎性细胞在气道周围的浸润减少、杯状细胞的增生减轻，气道黏液的分泌减少，同时气道的炎性评分也降低。OVA哮喘小鼠气道转染miR-493-5pagonliR后，BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞百分比和淋巴细胞百分比均较OVA哮喘组降低，提示在OVA哮喘小鼠模型中，miR-493-5p对气道炎症能够起到保护的作用。<br>　　结论:miR-493-5p在OVA哮喘模型中能够抑制Th9细胞分化，减轻气道炎症，miR-493-5p有望作为治疗哮喘的潜在靶点，这为未来哮喘的治疗提供了一定的论证依据。<br>　　第四部分 初步探索DCs分泌的外泌体miR-493-5p对Th9细胞分化的影响<br>　　目的:从外泌体miRNAs角度出发，初步探索DCs分泌的外泌体miR-493-5p对Th9细胞分化的影响。<br>　　方法:1、诱导分化OVA哮喘小鼠和对照组小鼠的BMDCs;qRT-PCR检测BMDCs外泌体miR-493-5p的表达水平。<br>　　2、从WT小鼠骨髓中诱导分化树突状细胞(DendriticCells，DCs)，培养后收集细胞上清，采用超速离心法提取外泌体，并构建Exosome—miR-493-5pNC和Exosome-miR-493-5pinhibitor，转染NaiveCD4+T细胞，在Th9诱导分化培养体系中培养，72h后收集细胞，采用流式检测IL-9+细胞百分比。<br>　　结果:1、OVA哮喘小鼠的DCs外泌体来源的miR-493-5p表达量明显低于对照组。<br>　　2、在诱导NaiveCD4+T细胞向Th9方向分化时，加入DC来源的外泌体可以明显下调IL-9+细胞比例，使用DC外泌体miR-493-5pinhibitor则可以逆转这一改变。<br>　　结论:DC来源的外泌体miR-493-5p能够抑制Th9细胞的分化。